一種選擇與湖羊產(chǎn)肉性能相關(guān)的分子標記的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種選擇與湖羊產(chǎn)肉性能相關(guān)的分子標記的方法及其應(yīng)用，首先利用實時熒光定 量技術(shù)檢測湖羊Latsl基因在不同生長階段、不同組織和不同性別的表達特性，繼而分析 Latsl基因與YAP1基因、肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基 因、MyoG基因六個肌肉生長和肌纖維有關(guān)的主效基因的相關(guān)性，從而驗證Latsl可以作為 湖羊產(chǎn)肉性狀的分子標記的可能性。
【背景技術(shù)】
[0002] Lats 基因（Large tumor suppressor gene)(也稱 wts 基因），最早由 Xu 等在果 蠅中發(fā)現(xiàn)，它可能編碼一個絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一個腫瘤抑制基因，隨后它在哺乳動 物中的同源基因也被證實是腫瘤抑制基因，并且是CDKs負調(diào)因子家族中的成員。在哺乳 動物中，Lats家族包括Latsl和Lats2兩個成員，人類Latsl和Lats2基因分別位于染色 體6q24_25和13qll_12,其編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶在有絲分裂早期與細胞周期調(diào)控因子 CDC2激酶構(gòu)成有絲分裂復(fù)合物，參與細胞周期調(diào)控，為潛在的腫瘤抑制基因。Latsl缺陷的 小鼠將會引發(fā)軟組織肉瘤和卵巢腫瘤，缺失Lats2的小鼠將會導(dǎo)致胚胎致死。在體外細胞 培養(yǎng)中，Latsl已經(jīng)被證明能夠?qū)AP磷酸化。在人正常乳腺上皮細胞中過表達Latsl可降 低YAP介導(dǎo)的上皮細胞間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)和細胞迀移。 在小鼠胚胎成纖維細胞中，Hippo信號通道中Latsl通過Lats2的表達和YAP的穩(wěn)定性準 確的協(xié)調(diào)控制細胞生長和染色體的穩(wěn)定性。Latsl最近被確定為新興Hippo信號通道中的 一個中心角色，在控制器官大小、腫瘤、干細胞的分化和重建等過程中起著重要的作用。
[0003] 動物的產(chǎn)肉性能包含肌肉細胞的生長和肌纖維的分化。在現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有研 宄發(fā)現(xiàn)以及證明Latsl基因可以作為湖羊產(chǎn)肉性狀的分子標記的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種選擇與湖羊產(chǎn)肉性能相關(guān)的分子標記的方法及其應(yīng)用。
[0005] 本方法首先利用實時熒光定量技術(shù)檢測湖羊Latsl基因在不同生長階段、不同組 織和不同性別的表達特性，繼而分析Latsl基因與YAP1基因、肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、 MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因六個肌肉生長和肌纖維有關(guān)的主效基因 的相關(guān)性，從而驗證Latsl可以作為湖羊產(chǎn)肉性狀的分子標記的可能性。
[0006] 本研宄選擇六個與肌細胞增值和肌纖維分化有關(guān)的主效基因作為篩選新的與產(chǎn) 肉性能有關(guān)的分子標記的依據(jù)，這些主效基因包括：YAP1是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它既可以 作為共激活因子，也可以作為輔阻遏物，它是位于Hippo通路下游的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，YAP1由 Latsl/2磷酸化，抑制其易位進入細胞核，來調(diào)節(jié)與細胞增殖、細胞死亡以及細胞迀移相關(guān) 的重要因子。研宄表明，YAP1在細胞增殖與凋亡的調(diào)控、器官大小的控制、細胞接觸性抑制 乃至腫瘤的發(fā)生過程中有重要作用。肌肉生長抑制因子（myostatin，MSTN)基因，也被稱為 轉(zhuǎn)化生長因子8(GDF-8)，是TGF-0超家族成員之一，在骨骼肌中廣泛表達，是肌肉生成中 的一個負調(diào)控因子，通過控制成肌細胞的增殖來發(fā)揮作用。MSTN可以通過Smad蛋白的介 導(dǎo)抑制成肌細胞的分化。肌細胞生成素（myogenin，MyoG)基因是MRFs基因家族成員，其中 MyoG基因是MyoD家族最重要的成員之一，是肌細胞終末端分化的關(guān)鍵因子，能夠在調(diào)控肌 細胞生成的過程中起核心作用，其表達可以終止成肌細胞的增殖，調(diào)節(jié)單核成肌細胞融合 為多核肌細胞的過程，也是MyoD基因家族中唯一在所有骨骼肌成肌細胞增殖分化的所有 時期均有表達的基因，是骨骼肌發(fā)育的一種正調(diào)控因子。肌球蛋白廣泛存在于肌細胞中，是 骨骼肌的主要收縮蛋白。肌球蛋白含有兩個重鏈和兩對輕鏈組成，根據(jù)肌纖維類型可以分 為多種類型，包括MyHC I、MyHClI A、MyHClI X等。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：首先利用實時熒光定量技術(shù)分析Latsl基因在湖羊中的 時空表達，繼而分析Latsl基因與YAP1基因、肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、MyHC II A、 MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因的表達相關(guān)性。
[0008] 本發(fā)明所提供的用于分析Latsl基因在骨骼肌表達的方法，是利用實時熒光定量 技術(shù)分析Latsl在不同肌肉組織、不同生長階段、不同性別的肌肉組織中的表達情況。
[0009] 本發(fā)明所提供的用于分析Latsl基因與其他主效基因關(guān)聯(lián)的方法，是分析Latsl 與YAP1基因、肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基 因在不同肌肉組織表達相關(guān)性關(guān)系分析，以及Latsl與YAP1基因、肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同生長階段表達相關(guān)性分析。
[0010] 本發(fā)明所述的實時熒光定量技術(shù)分析Latsl在骨骼肌中的表達情況，是使用 ABI7500熒光定量PCR儀，通過提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄方法獲得不同組織樣品cDNA，然后進 行實時熒光定量分析。
[0011] 本發(fā)明的方法步驟包括：
[0012] 選擇三個階段的試驗動物湖羊，包括初生期、斷奶期和成熟期的公湖羊和母湖羊； 對每個階段的湖羊選取飼養(yǎng)條件相同、生長發(fā)育良好、體重相近的湖羊進行屠宰。
[0013] 分別采每個階段湖羊的集背最長肌、比目魚肌、腓腸肌、趾長伸肌四種肌肉組織于 液氮罐保存，然后轉(zhuǎn)移至冰箱冷凍保存。
[0014] 根據(jù)GenBank已公布的7種基因（YAP1基因、MyHC I基因、MyHC II A基因、 MyHC II X基因、MSTN基因和MyoG基因和Latsl基因）和內(nèi)參基因18S的CDS區(qū)序列，設(shè)計 實時熒光定量PCR引物并合成引物。
[0015] 用Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成cDNA。以合成的不同組織樣品的cDNA 為模板，根據(jù)所設(shè)計的基因引物對湖羊不同組織的表達量進行分析。
[0016] 米用SPSS16. 0計算重復(fù)樣品間Ct均值以及標準偏差，米用2_ AA Ct方法處理 數(shù)據(jù)，2- A A Ct表示實驗組目的基因的表達相對于對照組變化的倍數(shù)分析基因相對表達 差異量。
[0017] 本發(fā)明的方法采用實時熒光定量技術(shù)，可以檢測出Latsl在不同生長階段、不同 性別、不同肌肉組織中的表達，可以迅速簡便的分析Latsl在骨骼肌中的表達情況。本發(fā)明 的方法還包括分析Latsl與YAP1基因、肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X) 基因、MSTN基因、MyoG基因在不同肌肉組織表達相關(guān)性關(guān)系分析，以及Latsl與YAP1基因、 肌球蛋白重鏈亞型（MyHC I、MyHC II A、MyHC II X)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同生長 階段表達相關(guān)性分析。本發(fā)明的方法為研宄湖羊Latsl基因在肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮作 用奠定了基礎(chǔ)。