豬藍耳病病毒、高致病性豬藍耳病病毒和豬瘟病毒三重?zé)晒舛繖z測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒的診斷領(lǐng)域，具體涉及一種能同時檢測豬藍耳病病毒、高致病性 豬藍耳病病毒和豬瘟病毒的三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟是由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸 性熱性傳染病，該傳染性高，致病性強，豬是本病唯一的自然宿主，感染的病豬主要表現(xiàn)為 特征性病理變化，內(nèi)臟出血，梗塞和壞死，死亡率很高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。病 豬是最主要的傳染源，易感豬與病豬的直接接觸是病毒傳播的主要方式。在我國，豬瘟流 行呈現(xiàn)典型豬瘟和非典型豬瘟共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共 存等形式；在國外，比利時、德國、荷蘭最近爆發(fā)豬瘟也說明豬瘟流行形式發(fā)生了改變。豬 瘟新的流行形式給全世界養(yǎng)豬業(yè)提出了新的挑戰(zhàn)。CSFV與牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV)和羊邊界病毒（Border Disease Virus，BDV)同屬黃病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒屬（pestivirus)。豬瘟病毒基因組為單股正鏈RNA長約12. 3KB， 含有一個大的開放閱讀框架。病毒粒子呈球形，直徑40-50nm，二十面體對稱，其芯髓直徑 29-30nm，有囊膜。
[0003] 豬藍耳病與呼吸綜合征，是由豬藍耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，在大多數(shù)國家中呈 流行性感染。豬發(fā)病后臨床表現(xiàn)差異極大，是該病的顯著特征之一。臨床癥狀主要是繁殖障 礙，包括懷孕后期流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎，育成豬的呼吸道癥狀。發(fā)病母豬體溫升高，厭食，部分 患豬的背側(cè)、雙耳的耳尖及邊緣呈紅藍色。發(fā)病公豬性欲減退，生產(chǎn)性能下降。發(fā)病仔豬出 生時死亡或產(chǎn)出后個體小?；钾i死亡后的主要病理變化是：眼球腫脹突出，頭、臀部皮下水 月中，胸腔、心包積水，心室擴張，心肌變化萎縮，腎臟皮質(zhì)部點狀出血，肺臟間質(zhì)性肺炎病變。 1991年病原首次鑒定，病毒是單鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，但是病毒的 來源并未確定。1985年美國豬群豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清抗體的存在說明該病毒在發(fā) 病之前就已經(jīng)存在。
[0004] 2006年我國南方部分省份出現(xiàn)養(yǎng)豬場（戶）暴發(fā)豬"高熱病"疫情，發(fā)病豬以"高 熱"、"高發(fā)病率"和"高死亡率"為主要特征，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。中國 動物疫病預(yù)防控制中心田克恭等研宄發(fā)現(xiàn)，豬"高熱病"的主要致病病原為Nsp2缺失30個 氨基酸的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異引起，后將其命名為"高致病性豬藍耳病"（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，其致 病性大大增加，仔豬發(fā)病率可達100%、死亡率可達50%以上，母豬流產(chǎn)率可達30%以上， 育肥豬也可發(fā)病死亡。依據(jù)PRRSV結(jié)構(gòu)基因序列的不同可以將其分為歐洲型和美洲型兩種 基因型，而依據(jù)其致病力的不同，又可將其中的美洲型PRRSV分為經(jīng)典株和高致病性株兩 種亞型。
[0005] 常規(guī)的豬瘟病毒和豬藍耳病病毒的實驗室檢驗方法是根據(jù)免疫反應(yīng)原理，利用 ELISA及雙夾心ELISA法進行檢測。目前，國內(nèi)外已對豬瘟的結(jié)構(gòu)蛋白基因進行了詳盡的 研宄，國外有學(xué)者分別對CSFVAlfort株和BreSCia株基因進行了全序列測定，并通過免疫 學(xué)方法證明囊膜糖蛋白E1是CSFV誘導(dǎo)保護性中和抗體的重要抗原，而國內(nèi)則對于石門株 (Shimen)的基因序列進行了測定。通過RT-PCR技術(shù)將編碼相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，轉(zhuǎn)入載體進行表達，并將表達產(chǎn)物進行純化、定量以及作為抗原包板做ELISA進行 感染檢測。另外豬瘟兔化弱毒EZ蛋白A/D區(qū)的高效表達和蛋白純化后亦可以作為包被抗 原進行ELISA測定，但是由于不能區(qū)分自然感染的和免疫接種。PRRSV可以從各種臨床樣 品中分離到，包括血清、血漿、外周血單核細胞、骨髓、扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)、胸腺、脾臟、心、 腦、肝、翠丸、附翠、輸精管、尿道球腺、陰莖組織、□咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盤、唾液、尿液、 糞便以及精液中。一般來說，肺臟深處積液以及血清都是病毒分離最理想的材料。送檢材 料通常應(yīng)包括新鮮采集的肺、扁桃體以及淋巴結(jié)。但是只有當特定滴度的標準病毒在新巨 噬細胞生長良好，方可使用。冰凍切片免疫熒光抗體試驗（IFA)以及免疫組化試驗（IHC) 可以檢測組織中的PRRSV抗原。冰凍切片直接FA試驗成本較低并且快速，這兩種方法的 特異性很高，但相對來說敏感性不夠。樣品的質(zhì)量對FA結(jié)果影響非常大，要求組織應(yīng)該新 鮮。IHC可以檢測甲醛固定的組織，比FA的敏感性要高，但更費時而且成本更高。通過組織 病理學(xué)切片，結(jié)合IHC以及FA試驗的結(jié)果可以對PRRSV感染做出準確的診斷。另外，針對 上述兩種病毒可以用RT-PCR技術(shù)進行檢測。通常是用異硫氰酸肌一酚一仿一步抽提法提 取病料細胞總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，再以此產(chǎn)物為模板對可疑的豬瘟或者豬藍耳病病料進行 了 PCR擴增。如果擴增出相應(yīng)的片段則說明病毒的存在，敏感性要高于熒光抗體染色法、酶 標單克隆抗體染色法和電鏡負染法，可以作為一種有效的診斷方法。概括來說豬瘟病毒和 豬藍耳病病毒的檢測方法主要包括免疫學(xué)檢測方法和核酸檢測方法兩大類。免疫學(xué)方法主 要是檢測血清中是否存豬瘟和豬藍耳病病毒的特異性抗體，具體是用ELISA的方法進行檢 測，然而這種方法必須是建立在已經(jīng)發(fā)生病毒感染并產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)上，而且鑒于上述病 毒的高度變異性以及與其他病毒血清學(xué)的交叉性，其特異性難以保證，容易出現(xiàn)假陽性和 假陰性。病毒分離和培養(yǎng)法比較敏感，但是這種方法操作繁瑣，不宜在所有檢測實驗特別是 一些基層實驗室推廣。用普通PCR的方法進行豬瘟或者豬藍耳病病毒核酸，雖然靈敏度有 所提高，但是容易產(chǎn)生非特異性擴增，甚至?xí)驗椴僮鞯脑虺霈F(xiàn)假陽性，而且普通PCR擴 增法其結(jié)果的判斷需要對產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，操作方法不夠簡化。
[0006] 熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時 監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，該方法操作方便 快捷。CN101058830A公開了 "豬瘟病毒熒光定量RT-PCR診斷試劑盒"，CN101328506A公開 了"一種特異檢測豬瘟病毒野毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法"。兩篇 文獻均只對豬瘟病毒進行了單獨檢測。豬瘟和豬藍耳病是嚴重危害豬的病毒性疾病，常以 單獨或混合感染的方式感染豬，發(fā)病率和死亡率都較高。目前針對豬瘟病毒和豬藍耳病病 毒感染的聯(lián)合檢測方法還未完善，而對高致病性豬藍耳病毒的檢測也仍然在探索階段。目 前還沒有能夠同時對豬藍耳病病毒、高致病性豬藍耳病病毒和豬瘟病毒進行同時檢測的相 關(guān)試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種具可同時用于豬藍耳病病毒美洲型經(jīng) 典株、高致病株和豬瘟病毒三種病毒的聯(lián)合熒光定量檢測。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 豬藍耳病病毒、高致病性豬藍耳病病毒和豬瘟病毒三重?zé)晒舛繖z測試劑盒，其 包括以下檢測引物和探針：
[0010] A、豬瘟病毒的特異性引物
[0011] 上游引物：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
[0012] 下游引物：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
[0013] 豬瘟病毒的特異性探針
[0014] 熒光探針：CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3
[0015] B、藍耳病病毒美洲株的特異性引物
[0016] 上游引物：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
[0017] 下游引物：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
[0018] 藍耳病病毒美洲株的特異性探針
[0019] 熒光探針：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1
[0020] C、高致病藍耳病病毒的特異性引物
[0021] 上游：TGTCCCCAAGCTGATGACAC
[0022] 下游：ATGGTGCTAAGGGGAAAGCC
[0023] 高致病藍耳病病毒的特異性探針
[0024] 探針：HEX-CGTAGAACTGTGACA-MGB
[0025] 進一步，所述檢測試劑盒還包括病毒總RNA萃取試劑、RT-QPCR混合酶液、RNase Free dH20、陽性對照和陰性對照中的一種或多種。
[0026] 其中，所述引物和探針包含于RT-QPCR反應(yīng)液中，該反應(yīng)液還包括Mg2+和dNTPs。 Mg 2+可以是常用的MgCl 2形式，濃度為0. 05M，dNTPs的濃度為0. 2M，引物和探針優(yōu)選的濃度 為各0. 5M，緩沖液為TrisM針優(yōu)選的濃緩沖液（0. 01M pH8. 0)。當然，也可以按照常規(guī)方式 將各試劑單獨存放，在使用時進行配置，通常這種方式可以延長試劑的保存期限。然而，本 發(fā)明對引物和探針的選擇，包括熒光試劑的選擇已經(jīng)對穩(wěn)定性進行了優(yōu)化，該混合反應(yīng)液 能在低溫下保存6個月。
[0027] 其中，所述病毒總RNA萃取試劑包括TRIZ0L試劑、氯仿/異戊醇和異丙醇。
[0028] 其中，所述RT-QPCR混合酶液包括RNA酶抑制劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。
[0029] 其中，所述陽性對照包括豬藍耳病病毒美洲株基因組RNA，高致病性豬藍耳病病毒 基因組RNA和豬瘟病毒RAN。
[0030] 其中，所述陰性對照為空白緩沖液。
[0031] 本試劑盒基于三重RT熒光定量PCR技術(shù)，同時檢測豬藍耳病病毒分子，高致病豬 藍耳病病毒分子和豬瘟病毒分子，用于動物肺、淋巴結(jié)、脾臟、腎、心、肝、血液及肉品等低微 含量樣品的檢測，診斷樣品供體是否染毒，適用于活畜和肉品檢疫。
[0032] 本發(fā)明試劑盒的特異性好、靈敏度高、三種常見豬病毒聯(lián)合檢測大大降低了檢測 成本，節(jié)省了檢測時間，能在疫情爆發(fā)時便于在短時間內(nèi)確定疫病的種類。
【具體實施方式】
[0033] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0034] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0035] 實施例1弓丨物及探針的設(shè)計與篩選
[0036] 在RT-PCR檢測中，引物及探針的設(shè)計直接影響到檢測的特異性及靈敏性。尤其是 在多重RT-PCR檢測中，不同引物及探針之間又存在著相互之間的影響。本發(fā)明在充分考慮 相關(guān)因素后，設(shè)計了若干組引物及探針，但不盡如意，然而意外發(fā)現(xiàn)以下引物及探針組顯示 出良好的特異性及靈敏性。
[0037] 1?豬瘟病毒的特異性引物
[0038] 上游引物：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
[0039] 下游引物：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
[0040] 豬瘟病毒的特異性探針
[0041] 熒光探針：CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3
[0042] 2.藍耳病病毒美洲株的特異性引物