結(jié)合HER3 β-發(fā)夾的HER3抗原結(jié)合蛋白的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】結(jié)合HER3 發(fā)夾的HER3抗原結(jié)合蛋白
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合HER3 e -發(fā)夾的抗HER3抗原結(jié)合蛋白（例如抗HER3抗體），用 于選擇這些抗原結(jié)合蛋白的方法，它們的制備及作為藥物的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] HER蛋白質(zhì)家族由4個(gè)成員組成：HER1，也稱(chēng)作表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)或 ErbB-1 ;HER2,也稱(chēng)作 ErbB-2 ;ErbB-3,也稱(chēng)作 HER3 ;和 ErbB-4,也稱(chēng)作 HER4。ErbB 家族蛋 白質(zhì)是受體酪氨酸激酶且代表細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介導(dǎo)物。ffiR家族蛋白質(zhì)代表不 同配體（像神經(jīng)調(diào)蛋白（NRG)家族、雙調(diào)蛋白、EGF和TGF-a)的受體。調(diào)蛋白（也稱(chēng)作HRG 或神經(jīng)調(diào)蛋白NRG-1)是例如HER3和HER4的配體。
[0004] 人 HER3 (ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3,受體酪氨酸蛋白質(zhì)激酶 erbB-3, SEQ ID NO:3)編碼受體酪氨酸激酶的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)家族的一個(gè)成員，該家族還 包括 HER1(也稱(chēng)作 EGFR)、HER2、和 HER4 (Kraus, M.H.et al.，PNAS 86:9193-9197(1989); Plowman, G. D. et al. , PNAS 87:4905-4909 (1990) ；Kraus, M. H. et al. , PNAS 90:2900-2904(1993))。就像原型表皮生長(zhǎng)因子受體，跨膜受體HER3由胞外配體結(jié)合域 (ECD)、ECD內(nèi)的二聚化域、跨膜域、胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶域（TKD)和C端磷酸化域組成。 這種膜結(jié)合蛋白質(zhì)具有在胞內(nèi)域內(nèi)的調(diào)蛋白（HRG)結(jié)合域，但是沒(méi)有活性激酶域。因此，它 能結(jié)合這種配體但沒(méi)有經(jīng)由蛋白質(zhì)磷酸化將信號(hào)傳遞入細(xì)胞。然而，它確實(shí)與確實(shí)具有激 酶活性的其它ffiR家族成員形成異二聚體。異二聚化導(dǎo)致受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活及 其胞內(nèi)域轉(zhuǎn)磷酸化。ffiR家族成員之間的二聚體形成擴(kuò)充J1ER3的信號(hào)傳導(dǎo)潛力，而且不僅 是信號(hào)多樣化的手段而且是信號(hào)放大的手段。例如，J1ER2/HER3異二聚體經(jīng)PI3K和AKT途 徑誘導(dǎo)HER家族成員中最重要的促有絲分裂信號(hào)之一（51丨》1?)￥81^，]\0.6丨31.，]\13;[01. Chem. 269:14661-14665(1994) ；Alimandi, M. et al.,Oncogene. 10:1813-1821 (1995)； Hel Iyer, N. J. , J. Biol. Chem. 276: 42153-4261 (2001) ； Singer, E. , J. Biol. Chem. 276:44266-44274 (2001) ;Schaefer，K.L.，Neoplasia 8:613-622(2006))。關(guān)于 HER3 及其在HER受體家族和NGR配體家族內(nèi)的各種相互作用的概述參見(jiàn)例如Sithanandam, G. et al.，Cancer Gene Therapy 15:413-448(2008)。
[0005] 已經(jīng)在眾多癌癥中報(bào)告了這種基因的擴(kuò)增和/或其蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)，包括前列 腺、膀胱、和乳腺腫瘤。已經(jīng)表征了編碼不同同等型的可變轉(zhuǎn)錄剪接變體。一種同等型缺乏 膜間區(qū)且分泌到細(xì)胞外。這種形式起調(diào)控膜結(jié)合形式的活性的作用。另外的剪接變體也已 有報(bào)告，但是它們尚未徹底表征。
[0006] 有趣的是，在其平衡狀態(tài)，HER3受體以其"閉合構(gòu)象"存在，這確實(shí)意味著HER3 發(fā)夾基序的異二聚化經(jīng)非共價(jià)相互作用系留至ffiR3 E⑶域IV(見(jiàn)圖lc和Id)。假 定"閉合"HER3構(gòu)象能經(jīng)配體調(diào)蛋白在特定HER3調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)處的結(jié)合而開(kāi)放。這 發(fā)生于由HER3 E⑶域I和域III形成的HER3界面。通過(guò)這種相互作用，認(rèn)為HER3受 體活化并轉(zhuǎn)變成它的"開(kāi)放構(gòu)象"（見(jiàn)圖le和lb和例如Baselga, J. et al.，Nat. Rev. Cancer 9:463-475(2009)和 Desbois_Mouthon，C.et al.，Gastroenterol Clin Biol 34:255-259(2010))。在這種開(kāi)放構(gòu)象中，與HER2的異二聚化和轉(zhuǎn)信號(hào)誘導(dǎo)是可能的（見(jiàn) 圖 lb)。
[0007] WO 2003/013602 涉及 HER 活性的抑制劑，包括 HER 抗體。WO 2007/077028 和 TO 2008/100624 也涉及 HER3 抗體。WO 97/35885 和 WO 2010/127181 涉及 HER3 抗體。
[0008] W0 2012/22814涉及凍結(jié)"閉合或無(wú)活性構(gòu)象"的HER3抗體，這意味著它們凍 結(jié)HER3的平衡狀態(tài)（見(jiàn)圖1)，使得HER3 0-發(fā)夾在處于這種平衡狀態(tài)時(shí)不可及。TO 2012/22814中的HER3抗體不結(jié)合以活性三維取向例如在SlyD支架內(nèi)呈遞的HER3 0 -發(fā) 夾（見(jiàn)例如圖17和2,和例如SEQ ID N0:18的多肽）。
[0009] 人HER4(也稱(chēng)作ErbB-4、ERBB4、v-erb-a、成紅細(xì)胞白血病病毒癌基因同系物 4、pl80erbB4、鳥(niǎo)類(lèi)成紅細(xì)胞白血病病毒（v-erb-b2)癌基因同系物4;SEQ ID N0:5)是 I型單次跨膜蛋白質(zhì)，具有多個(gè)弗林蛋白酶樣富含半胱氨酸域、酪氨酸激酶域、磷脂酰肌 醇-3 激酶結(jié)合位點(diǎn)和 PDZ 域結(jié)合基序（Plowman, G.D.et al.，PNAS 90:1746-50(1993); Zimon j ic, D. B. et al. , Oncogene 10:1235-7 (1995) ；Culouscou, J. M. et al. , J. Biol. Chem. 268:18407-10 (1993))。該蛋白質(zhì)結(jié)合神經(jīng)調(diào)蛋白-2和-3、肝素結(jié)合性EGF樣生長(zhǎng)因 子和0細(xì)胞素并被它們活化。配體結(jié)合誘導(dǎo)多種細(xì)胞應(yīng)答，包括有絲分裂和分化。多種蛋 白水解事件容許胞質(zhì)片段和胞外片段釋放。已經(jīng)將這種基因中的突變與癌癥關(guān)聯(lián)起來(lái)。編 碼不同蛋白質(zhì)同等型的可變剪接變體已有記載；然而，并非所有變體均已完全表征。
[0010] 用于抗癌療法的抗冊(cè)1?4抗體是已知的，例如來(lái)自舊5,811，098，舊7,332,579或 Hoilm6n, M. et al.，Oncogene. 28:1309-19 (2009)(抗 ErbB-4 抗體 mAb 1479)〇
[0011] 至今不可能選擇特異性結(jié)合ffiR3 發(fā)夾的抗原結(jié)合蛋白（特別是抗體），因?yàn)?這種HER3 0 -發(fā)夾呈遞隱藏的表位，在HER3處于平衡狀態(tài)時(shí)不可及（見(jiàn)圖1)。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 我們現(xiàn)在已經(jīng)找到了一種使用在SlyD支架（見(jiàn)例如圖2,和SEQ ID N0:13和17 至24的多肽）內(nèi)以三維取向功能性呈遞的HER3 (和用于逆篩選的HER4) 0 -發(fā)夾來(lái)獲得此 類(lèi)抗體的方法。
[0014] 本發(fā)明提供一種用于選擇結(jié)合人HER3 (且不與人HER4交叉反應(yīng)）的抗原結(jié)合蛋 白（特別是抗體）的方法，其中該抗原結(jié)合蛋白（特別是抗體）在人ffiR3的氨基酸序列 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)內(nèi)結(jié)合，其中使用
[0015] a)至少一種選自下組的包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的多肽：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于選擇結(jié)合人HER3的抗原結(jié)合蛋白的方法，其中該抗原結(jié)合蛋白在人HER3 的氨基酸序列 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)內(nèi)結(jié)合， 其中使用 a) 至少一種選自下組的包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的多肽：
和 b) 至少一種選自下組的包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽：
來(lái)選擇顯示結(jié)合a)下的至少一種多肽且顯示不結(jié)合b)下的至少一種多肽的抗原結(jié)合 蛋白， 并由此選擇在人HER3的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)內(nèi)結(jié)合且不 與人HER4交叉反應(yīng)的抗原結(jié)合蛋白。
2. 通過(guò)權(quán)利要求1的選擇方法獲得的抗原結(jié)合蛋白。
3. 權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求2的抗原結(jié)合蛋白，其中該抗原結(jié)合蛋白為抗體。
4. 一種分離的結(jié)合人HER3的抗原結(jié)合蛋白， a) 其中該抗原結(jié)合蛋白結(jié)合多肽SEQ ID N0:18 TtSlyDcys-Her3,且 b) 其中該抗原結(jié)合蛋白不與多肽SEQ ID N0:22 TtSlyDcys-Her4交叉反應(yīng)。
5. -種分離的結(jié)合人HER3的抗原結(jié)合蛋白， a) 其中該抗原結(jié)合蛋白在多肽SEQ ID NO: 18 (TtSlyDcas-Herf)中包含的氨基酸序列 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)內(nèi)結(jié)合，且 b) 其中該抗原結(jié)合蛋白不與多肽SEQ ID N0:22(TtSlyDCaS-Her4)中包含的氨基酸序 列 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID N0:2)交叉反應(yīng)。
6. 權(quán)利要求4或5的抗原結(jié)合蛋白，其中該抗原結(jié)合蛋白為抗體。
7. -種分離的結(jié)合人HER3的抗體，其中該抗體結(jié)合活化的HER3中的氨基酸序列SEQ ID NO:1〇
8. 權(quán)利要求6至7中任一項(xiàng)的抗體，其中該抗體顯示與在調(diào)蛋