GF表達(dá)抑制用核酸分子，其具有細(xì)胞內(nèi)穿透能力，其特 征在于，由包含與編碼結(jié)締組織生長因子（Connective tisssue frowth factor，CTGF) 的mRNA互補(bǔ)區(qū)域的第一鏈和與所述第一鏈形成互補(bǔ)結(jié)合的第二鏈構(gòu)成的誘導(dǎo)RNAi的 雙鏈核酸分子中，所述核酸分子中含有的1~31個(gè)核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)或者二硫代磷酸醋（phosphorodithioate)取代，并結(jié)合有親油性化 合物，所述誘導(dǎo)RNAi的雙鏈核酸分子具有選自于由序列號153以及154的堿基序列對所組 成的組中的堿基序列對。
[0021] 通過下述的詳細(xì)說明以及所附的權(quán)利要求書，能夠更加明確本發(fā)明的其它特征以 及具體例。
【附圖說明】
[0022] 圖1是表示siRNA、asiRNA、lasiRNA結(jié)構(gòu)體對表1至表3的以CTGF作為靶標(biāo)的 24種序列的基因抑制效率的圖表。
[0023] 圖2是表示膽固醇修飾使lasiRNA的細(xì)胞內(nèi)吸收效率增加的熒光顯微鏡觀察照 片。
[0024] 圖3表示本發(fā)明的膽固醇以及PS修飾的lasiRNA結(jié)構(gòu)（下劃線：0Me修飾 (modification)，* :PS 修飾（modification)，Choi :膽固醇（Cholesterol)，Cy3 :Cy3) 〇
[0025] 圖4是表不硫代磷酸醋（Phosphorothioate) (PS)修飾使chol-lasiRNA向細(xì)胞內(nèi) 的吸收效率增加的熒光顯微鏡觀察照片。
[0026] 圖5是硫代磷酸醋（Phosphorothioate) (PS)修飾使chol-lasiRNA的基因減少的 效果比較圖（各圖表表示三次反復(fù)試驗(yàn)的平均和SD)。
[0027] 圖6表示將MyD88作為靶標(biāo)的chol-lasiRNA-PS7的結(jié)構(gòu)（下劃線：0Me修飾 (modification)，* :PS 修飾（modification)，Choi :膽固醇（Cholesterol))。
[0028]圖 7 是對各種細(xì)胞穿透性 lasiRNA(cell penetrating lasiRNA，cp-lasiRNA)的 基因抑制效率進(jìn)行比較的圖表（括號內(nèi)的CTGF或者M(jìn)yD88表示cp-lasiRNA的靶標(biāo)基因）。
[0029]圖8是表示親油性化合物修飾即疏水性修飾帶來的本發(fā)明核酸分子的基因抑制 效率的圖表。
[0030]圖9是表示反義鏈長度帶來的本發(fā)明核酸分子的基因抑制效率的圖表。
[0031] 圖10是PS2修飾的結(jié)構(gòu)。
[0032]圖11是表示磷酸骨架修飾帶來的本發(fā)明核酸分子的基因抑制效率的圖表。
[0033] 圖12是表示本發(fā)明核酸分子的體內(nèi)（in vivo)靶標(biāo)基因抑制效率的圖表。
[0034]圖13是表示本發(fā)明核酸分子在各濃度下的體內(nèi)（in vivo)靶標(biāo)基因抑制效率的 圖表。
[0035] 圖14是表示本發(fā)明的核酸分子在各時(shí)間段對靶標(biāo)基因抑制效率的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 除非另有定義，本說明書中使用的所有技術(shù)用語和科學(xué)用語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人 員的通常理解相同的意義。一般來說，本說明書中使用的命名法在該技術(shù)領(lǐng)域中廣為人知 且常規(guī)使用。
[0037] 本發(fā)明的詳細(xì)說明等中使用的主要用語的定義如下。
[0038] 本申請中"RNAi(RNA干擾：RNA interference)"是指，在細(xì)胞等中導(dǎo)入由具有與 靶基因的mRNA同源序列的鏈和具有與靶基因的mRNA互補(bǔ)序列的鏈構(gòu)成的雙鏈RNA (dsRNA) 而誘導(dǎo)靶基因mRNA的分解，由此抑制靶基因的表達(dá)的機(jī)制。
[0039] 本申請中"siRNA (小干擾RNA :small interfering RNA) "是指，序列特異性地介 導(dǎo)有效的基因表達(dá)抑制（基因沉默：gene silencing)的短雙鏈的RNA (dsRNA)。
[0040] 本申請中"反義鏈（antisense strand) "是指，對所需的革巴核酸（target nucleic acid)實(shí)際上或者100 %互補(bǔ)的多核苷酸，例如，可與mRNA (信使RNA :messenger RNA)、不 是 mRNA 的 RNA 序列（例如，微小 RNA :microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA 以及 hnRNA)、或者編 碼DNA序列或非編碼DNA序列整體互補(bǔ)或一部分互補(bǔ)。本申請中，反義鏈和引導(dǎo)鏈可以相 互替換使用。
[0041] 本申請中"正義鏈（sense strand) "是指，具有與革巴核酸相同的核酸序列的多 核苷酸，是與mRNA (信使RNA :messenger RNA)、不是mRNA的RNA序列（例如，微小RNA : microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA以及hnRNA)、或者編碼DNA序列或非編碼DNA序列整體相 同或一部分相同的多核苷酸。
[0042] 本申請中"基因"應(yīng)視為最廣泛的含義，其可以編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。 此時(shí)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)包含轉(zhuǎn)錄因子、熱休克蛋白或者DNA/RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯相關(guān)的蛋 白質(zhì)。本發(fā)明中，成為表達(dá)抑制的對象的靶基因駐留于病毒基因組中，可整合成動(dòng)物基因或 可以以染色體外構(gòu)成要素存在。例如，靶基因可以是HIV基因組上的基因。此時(shí)，siRNA分 子在使哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)HIV基因的翻譯失活方面有用。
[0043] 本發(fā)明的一實(shí)施方式涉及一種RNAi誘導(dǎo)用核酸分子，其具有細(xì)胞內(nèi)穿透能力 (cell-penetrating ability)，其特征在于，誘導(dǎo)RNAi的雙鏈核酸分子中，所述核酸分子 所含的至少一個(gè)核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯（Phosphorothioate)或者二硫代磷酸酯 (phosphorodithioate)取代，并結(jié)合有親油性化合物（lipophilic compound)，所述誘導(dǎo) RNAi的雙鏈核酸分子由包含與革巴核酸（target nucleic acid)互補(bǔ)區(qū)域的第一鏈和與所述 第一鏈形成互補(bǔ)結(jié)合的第二鏈構(gòu)成。此時(shí)，第一鏈對應(yīng)于siRNA的反義鏈，第二鏈對應(yīng)于正 義鏈。
[0044] 本發(fā)明中，所述誘導(dǎo)RNAi的雙鏈核酸分子中的第一鏈長度可以是16至121nt，優(yōu) 選為24至121nt長度。第一鏈包含與靶核酸互補(bǔ)的一部分區(qū)域，此時(shí)，其特征在于，包含與 靶核酸互補(bǔ)的一部分區(qū)域的區(qū)域長度是16至31nt、19至31nt或者19至21nt。進(jìn)一步，其 特征在于，第二鏈具有13至25nt長度、13至21nt長度或者16至21nt長度。
[0045] 優(yōu)選地，本發(fā)明的誘導(dǎo)用雙鏈核酸分子的特征在于，由包含與靶核酸互補(bǔ)的一部 分區(qū)域且長度24~121nt的第一鏈和長度13~21nt的第二鏈構(gòu)成，所述第二鏈具有和 所述第一鏈中與靶核酸互補(bǔ)的一部分區(qū)域形成互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。本發(fā)明的一實(shí)施例中，針 對CTGF作為靶標(biāo)的24種序列制作出具有如上所述結(jié)構(gòu)的核酸分子，結(jié)果確認(rèn)了與以往的 siRNA相比總體上顯示出更高的基因表達(dá)抑制效率的傾向。本發(fā)明人將如上所述的具有與 第二鏈不形成互補(bǔ)結(jié)合的長的單鏈區(qū)域的誘導(dǎo)RNAi用雙鏈核酸分子，即將具有長的反義 鏈的siRNA命名為"lasiRNA"。
[0046] lasiRNA是，雖然具有比以往的siRNA更短的雙鏈長度但具有高的基因抑制效 率的新型結(jié)構(gòu)的非對稱型RNAi誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)。另外，基于長的突出（overhang)結(jié)構(gòu)的反義 (antisense)作用，可帶來與siRNA或asiRNA相比增加的最大基因抑制效率，因此有望代替 以往的結(jié)構(gòu)而利用于治療劑的開發(fā)。另外，相比于其它結(jié)構(gòu)，具有更長的突出（overhang) 長度，且突出（overhang)的各種修飾（modification)也具有保持高的活性的性質(zhì)，因此其 具有能夠自由導(dǎo)入較多的化學(xué)修飾（chemical modification)而增加各種功能的特征。
[0047] 如上所述的lasiRNA的特征在于，所述第一鏈的與革E核酸（target nucleic acid)互補(bǔ)的一部分區(qū)域的長度是19~21nt。因此，所述第一鏈包含不與第二鏈結(jié)合的 單鏈區(qū)域，優(yōu)選第一鏈在單鏈區(qū)域中還包含選自于由反義DNA、反義RNA、核酶以及DNA酶 (DNAzyme)所組成的組中的核酸寡核苷酸。
[0048] 本發(fā)明的特征在于，所述第一鏈中不與第二鏈形成互補(bǔ)結(jié)合的單鏈區(qū)域可直接連 接或通過鏈接物連接于與所述第二鏈形成互補(bǔ)性結(jié)合的區(qū)域，此時(shí)，鏈接物是化學(xué)鏈接物 (chemical linker)。此時(shí)，上述化學(xué)鏈接物是核酸（核酸部分（a nucleic acid moiety))、 PNA(PNA 部分（a PNA moiety))、肽（肽部分（a peptide moiety))、二硫鍵（a disulfide bond)或者聚乙二醇（聚乙二醇部分（a polyethylene glycol moiety))，但并不限定于此。
[0049] 進(jìn)一步，本發(fā)明的特征在于，所述第一鏈可在單鏈區(qū)域上還含有與上述靶核酸互 補(bǔ)的序列，或者，含有與上述靶核酸不互補(bǔ)的序列，在互補(bǔ)的情況下，其可連續(xù)排列于本發(fā) 明的核酸分子的雙鏈區(qū)域中，即可連續(xù)排列于與siRNA的靶核酸互補(bǔ)的區(qū)域，或者，遠(yuǎn)離這 些區(qū)域而排列。同樣，siRNA革E標(biāo)的序列（sequence)和上述單鏈區(qū)域的核酶（ribozyme) 或DNA酶（DNAzyme)革E標(biāo)的序列（sequence)可以連續(xù)排列或遠(yuǎn)離排列。另外，當(dāng)所述第一 鏈的單鏈區(qū)域具有與所述siRNA的靶基因互補(bǔ)的序列的情況下，若單鏈區(qū)域所包含的序列 為反義DNA或者反義RNA時(shí)，則其特征在于，其序列與siRNA的靶基因的序列相互互補(bǔ)約 70-80%以上，優(yōu)選相互互補(bǔ)約80-90%以上，更加優(yōu)選相互互補(bǔ)約95-99%以上；單鏈區(qū)域 為核酶或者DNA酶（DNAzyme)時(shí)，其特征在于，其序列和siRNA的靶基因的序列相互互補(bǔ)約 50-60% 以