一種基因工程大腸桿菌op50品系及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因工程大腸桿菌0P50品系及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]飲食是影響動物壽命的一個非常重要的環(huán)境因素。所有動物都必須通過食物攝入養(yǎng)料來維持生命和生育，飲食還直接或間接影響動物的發(fā)育、代謝、行為和衰老。根據動物遺傳組成和生理狀態(tài)，飲食量不同、飲食中營養(yǎng)成分不同會造成不同的反應。飲食變化和異常飲食信號日益和人類疾病如肥胖、糖尿病、癌癥和心血管疾病聯系起來。
[0003]除了提供營養(yǎng)，飲食還間接通過腸道微生物來影響動物，例如動物腸道中的微生物幫助動物消化食物中宿主動物本身不能消化的纖維來生產短鏈脂肪酸，這些微生物還能合成一些微量營養(yǎng)物質如維生素。這些間接的飲食影響也同從糖尿病、抑郁癥到自閉癥等許多人類疾病聯系起來。盡管現在越來越認識到飲食的重要性以及飲食信號對健康的影響，這其中的復雜機制使得研宄背后遺傳基礎的工作充滿挑戰(zhàn)。
[0004]線蟲是在許多生物過程的研宄中廣泛應用的模式生物，線蟲以細菌為食，攝入的細菌在腸道中消化后為線蟲提供養(yǎng)料。細菌利用環(huán)境中的化學物質，合成一些必需微量營養(yǎng)物質例如線蟲自身不能合成的維生素。就這一點而言喂養(yǎng)線蟲的細菌直接為線蟲提供大量營養(yǎng)物質以及必須微量營養(yǎng)物質，這和哺乳動物中的情況是一樣的。此外，線蟲和人需要相似的必需營養(yǎng)物質以及相似的基礎代謝通路，這使得線蟲代表了一個研宄飲食的直接/間接影響包括宿主-微生物相互作用的非常易于遺傳操作的模式生物系統(tǒng)。
[0005]0P50是Sydney Brenner在他第一次介紹線蟲作為一種遺傳模式生物時選擇用來培養(yǎng)線蟲的。自那以后0P50就成為實驗室里標準的線蟲食物。它是一種B系大腸桿菌，為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷菌系，只能在培養(yǎng)板上形成較薄的菌苔，這樣就方便于在顯微鏡下觀察線蟲的形態(tài)、發(fā)育及行為(Brenner，1974)。在過去40年里，幾乎所有關于線蟲基因表達、發(fā)育、代謝、行為和衰老等的實驗數據都是用OP50收集的。RNAi是一種首先在線蟲中建立起來的基因工具，從1990年開始，RNA干擾成為一種有力的遺傳工具并使生物醫(yī)學研宄革命性發(fā)展(Fire et al.，1998)。現在已被廣泛用來描繪幾乎所有線蟲中的生物過程，包括很多RNAi的研宄，特別是大量的全基因組RNAi篩選。
[0006]但是關鍵資源的缺少阻礙了線蟲模型在飲食信號研宄中的應用，尤其是不能在喂食不同食物的蟲子上進行RNAi。在0P50中不能進行RNAi操作，所有RNAi數據都來自于一種K-12系大腸桿菌HT115，這種方法是基于給線蟲喂食表達針對特定基因的雙鏈RNA(dsRNA)的HT115細菌來引起基因沉默。對線蟲來說0P50和HTl 15是兩種在營養(yǎng)物質和代謝產物的量和組成上不同的食物，前者是正常飲食而后者是富營養(yǎng)的，因此這兩種飲食會對線蟲的基因表達產生不同影響，導致對線蟲整個生命周期各方面產生不同影響，包括而不僅限于發(fā)育、代謝、行為和衰老。因為技術上還不能在喂食0P50的線蟲上進行RNAi，我們還不能通過RNAi系統(tǒng)性地研宄飲食依賴對線蟲生物特性分差調節(jié)背后的遺傳基礎。此外，因為OP50和HTl 15對線蟲的影響不同，所以對比在HTl 15上的RNAi數據和文獻中通過0P50得到的數據很困難，這些不僅對針對不同飲食反應的，還對旨在排除飲食差分影響的研宄造成很大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種新的基因工程菌，可作為線蟲的標準食物等，用來進行多種生物學研宄。
[0008]本發(fā)明提供的基因工程大腸桿菌0P50品系，在其基因組中，敲除了 rnc基因，且attB位點插入有T7RNA聚合酶部件。
[0009]大腸桿菌0P50DNA上的rnc基因編碼產物為RNase III酶，RNase III酶能降解細菌中絕大多數dsRNA。基因敲除是通過一定的途徑使有機體特定的基因失活或缺失的技術。rnc基因被敲除后，其不能再合成RNase III酶，有效增加了細菌中雙鏈RNA的表達量。敲除rnc基因的目的是破壞其基因表達，只要起到破壞該基因表達的目的即可。
[0010]大腸桿菌0P50DNA上的att (attach)位點記為attB，長度為23bp，位于b1和gal基因之間，分B、0和B’三個序列組分。在attB位點插入T7RNA聚合酶基因序列后，使得相應RNA的表達具備可誘導性。雖然K-12系大腸桿菌HT115攜帶一個分離自DE3原噬菌體溶源化導入的IPTG誘導T7聚合酶部件，此部件可以起始質粒上dsRNA的合成。然而大腸桿菌0P50缺少這一結構，且該品系是抗λ噬菌體的，無法利用DE3溶源化來導入IPTG誘導Τ7聚合酶部件，大腸桿菌ΗΤ115的這種結構特征并不能在0Ρ50上重現。
[0011]經過努力，發(fā)明人發(fā)現attB位點能夠插入T7RNA聚合酶部件，T7RNA聚合酶部件特定插入到attb位點專一性重組需要的識別位點，沒有插到promoter后面，重組DNA片段中自帶啟動子。
[0012]通過在大腸桿菌0P50基因組中聯合進行這兩處改進后，新的基因工程菌能夠有效表達RNA，尤其是具有雙鏈結構的RNA，如具有回文結構的RNA等，同時也保證了 RNA表達的豐度和具備條件誘導表達特性。
[0013]作為優(yōu)選方案，上述基因工程大腸桿菌0P50品系中，rnc基因序列部分插入有miniTnlO轉座子。通過miniTnlO轉座子，該品系還獲得了四環(huán)素抗性。
[0014]所述miniTnlO轉座子的核苷酸序列如SEQIDN0.1?2所示。所述T7RNA聚合酶部件的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0015]miniTnlO 序列:
[0016]5’ - NGCTNAGCN — 3’ (SEQ ID N0.1)
[0017]3’ — NCGANTCGN — 5’ (SEQ ID N0.2)。其中 N 為任意堿基對。
[0018]SEQ ID N0.3:1PTG誘導的T7聚合酶序列參見序列表。
[0019]靶序列和共同順序愈相似，則轉位的頻率愈高。很可能轉位酶需要同時識別末端反向重復和靶序列二者方能發(fā)揮作用。
[0020]作為優(yōu)選方案，上述基因工程大腸桿菌0P50品系，名稱為大腸桿菌Escherichiacoli 0P50(xu363)，于2015年3月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號:CCTCCM2015138。
[0021]本發(fā)明還提供了一種上述基因工程大腸桿菌0P50品系的制備方法，是將來自rnc_大腸桿菌K8024的miniTnlO轉座子引入rnc基因中；將IPTG誘導T7RNA聚合酶部件插入到attB位點，得到基因工程大腸桿菌0P50品系。上述兩個操作順序不分先后，可以調換。
[0022]Red同源重組技術的原理是將一段攜帶與靶基因兩翼各有40?60bp同源序列的PCR片段導入宿主菌細胞，利用λ噬菌體Red重組酶的作用，使導入細胞的線性DNA片段與染色體(或載體)的特定靶序列進行同源重組，靶基因被標記基因置換下來。PCR引物由兩部分組成，靠近5’端的區(qū)域為與靶基因同源的序列(約40bp)，靠近3’段的區(qū)域(約20bp)與模板DNA互補。
[0023]作為優(yōu)選方案，上述基因工程大腸桿菌0P50品系的制備方法，具體步驟為:
[0024]敲除rnc基因:通過質粒轉染的方法將來自rnc—大腸桿菌K8024的miniTnlO轉座子引入0P50的rnc基因中；
[0025]插入T7RNA聚合酶基因序列:通過Red/ET介導的同源重組一個兩側是兩個FRT位點的卡那霉素抗性基因首先引入到大腸桿菌BL21 (DE3) ybhC和IacI基因中間，然后攜帶整個編碼T7聚合酶的基因片段和此卡那霉素抗性組件通過PCR擴增并通過第二步Red/ET介導的同源重組插入到經rnc基因敲除處理的0P50的attB位點，最后再通過FLP介導的重組將卡那霉素抗性組件去掉，最終得到的菌經PCR測序確認，獲得所述基因工程大腸桿菌0P50品系
[0026]本發(fā)明還提供上述基因工程大腸桿菌0P50品系作為秀麗隱桿線蟲的食物在研宄飲食對動物生命活動影響研宄中的應用。
[0027]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0028]1.實現了同時在OP50品系中破壞rnc基因表達以及增加T7聚合酶表達
[0029]線蟲以細菌為食，因此常規(guī)思路是把產生針對特定線蟲基因的dsRNA的質粒轉入作為食物的細菌中，這使得細菌成為產生和釋放dsRNA最方便的載體。有兩個理由使得HTl 15被選為宿主菌:其一，它攜帶一個插入可以編碼R