一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其大規(guī)模培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其大規(guī)模培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（Stem cell)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì)胞。 在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，間充質(zhì)干細(xì)胞具有干 細(xì)胞的共性，即自我更新、多向分化和歸巢的能力。在特定的機(jī)體外分化環(huán)境下，能夠誘導(dǎo) 分化為神經(jīng)、心臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細(xì)胞，被認(rèn)為是細(xì)胞治療技術(shù)的最有希 望的來(lái)源細(xì)胞之一，是近幾年研宄的熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞作為重要的再生醫(yī)學(xué)資源，在臨床 的疾病治療領(lǐng)域?qū)⒂蟹浅Ｖ匾膽?yīng)用價(jià)值。
[0003] 大量研宄證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以從骨髓分離得到，也存在于其他不同組織和臟 器，如肌肉、脂肪組織、臍血、臍帶、胎盤、血管等。但成體中的間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)隨著年齡的增 加，含量也會(huì)逐漸降低，而且增殖和分化的能力也會(huì)相應(yīng)的下降。所以，在臨床應(yīng)用上，需要 克服間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量少的技術(shù)瓶頸，研宄一種可大規(guī)模培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 對(duì)分離得到的原代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行高效擴(kuò)增顯得尤為重要。
[0004] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有較為成熟的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方法。在 間充質(zhì)干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)中，最常見(jiàn)的培養(yǎng)體系是采用DMEM/F12培養(yǎng)基加上體積比為 10%的胎牛血清（FBS)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與擴(kuò)增，但是間充質(zhì)干細(xì)胞在傳到5 代之后，細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生了改變，部分細(xì)胞出現(xiàn)了老化現(xiàn)象。而且FBS雖然可為間充質(zhì)干細(xì) 胞提供一些必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但FBS屬于動(dòng)物源性物質(zhì)，成分比較復(fù)雜，在臨床應(yīng)用上存在 潛在的風(fēng)險(xiǎn)，也增加了細(xì)胞污染的幾率。而且FBS是一種價(jià)格比較高的生物制品，在間充質(zhì) 干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)中，無(wú)疑會(huì)大大增加生產(chǎn)的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的 培養(yǎng)基及其大規(guī)模培養(yǎng)方法，本發(fā)明所述培養(yǎng)基克服MSC在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)對(duì)FBS的 依賴，避免FBS在臨床應(yīng)用上的潛在風(fēng)險(xiǎn)，降低細(xì)胞污染的幾率，同時(shí)對(duì)MSC的擴(kuò)增起到促 進(jìn)作用，延緩MSC在體外培養(yǎng)的老化速度。本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法可 獲得大量高純度間充質(zhì)干細(xì)胞，且能保持間充質(zhì)干細(xì)胞良好的干細(xì)胞特性，適用于所有類 型MSC的大規(guī)模培養(yǎng)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括無(wú)血清培養(yǎng)基和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血小板 衍生因子，其中所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為5ng/mL~10ng/mL，血小板衍生因子濃度為 5ng/mL ~10ng/mL〇
[0008] 本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基在無(wú)血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加表皮細(xì)胞生長(zhǎng) 因子（EGF)和血小板衍生因子（PDGF)，低濃度的EGF與TOGF聯(lián)合使用，可起到協(xié)同促進(jìn)MSC 的增殖作用，并延緩MSC在培養(yǎng)過(guò)程中的老化現(xiàn)象，使MSC在傳到第10代以上時(shí)，仍可以保 持較好的增殖及分化能力，保持原有的間充質(zhì)干細(xì)胞特性。
[0009] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為5ng/mL。
[0010] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述血小板衍生因子濃度為5ng/mL。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為lonza Ultra⑶LTURE MEDIUM無(wú)血清培 養(yǎng)基。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法，取原代分離培養(yǎng)的P1代 間充質(zhì)干細(xì)胞，用間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基調(diào)整接種密度為2X10 4/mL-3X105/mL，置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%后記為P2代細(xì)胞，重復(fù)傳代至P10代 細(xì)胞；所述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基包括無(wú)血清培養(yǎng)基和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血小板衍生 因子，其中所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為5ng/mL~10ng/mL，血小板衍生因子濃度為5ng/ mL ~10ng/mL〇
[0013] 本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法，適用于所有類型MSC的大規(guī)模培 養(yǎng)，所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞或外周血間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為lonza Ultra⑶LTURE MEDIUM無(wú)血清培 養(yǎng)基。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法具體為組織塊 剪碎，加入完全培養(yǎng)基，于37°C，5 % 0)2靜止培養(yǎng)，期間補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，待組織塊有細(xì)胞爬 出后去掉組織塊，清洗后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80 %~90 %后，去 掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，清洗后加入含胰蛋白酶消化液消化，完全培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清， 用完全培養(yǎng)基重懸。
[0016] 其中，在一些實(shí)施方案中，所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中所述完 全培養(yǎng)基包括無(wú)血清培養(yǎng)基和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血小板衍生因子，其中所述表皮細(xì)胞生 長(zhǎng)因子濃度為5ng/mL~10ng/mL，血小板衍生因子濃度為5ng/mL~10ng/mL。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中所述含胰蛋 白酶消化液中胰蛋白酶濃度為0.25v/v%，所含EDTA濃度為0. 04v/v%。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中所述原代分 離培養(yǎng)方法中消化液消化的時(shí)間為1 _2min。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中所述間充質(zhì) 干細(xì)胞來(lái)源與臍帶組織。所述臍帶可以取自產(chǎn)后棄置的臍帶組織，采用含有雙抗的PBS保 存。所述含有雙抗的PBS為含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液，其中青霉素工作濃度為 100U/mL，鏈霉素工作濃度為0. lmg/mL。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中所述臍帶預(yù) 先清洗表面血跡并消毒。在一些具體實(shí)施例中，所述臍帶用50mL~150mL無(wú)菌的PBS清洗 臍帶表面血跡，用50mL~150mL75%乙醇消毒臍帶表面，再用50mL~150mL PBS清洗數(shù)遍 盡量去除血跡。
[0021] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述臍帶預(yù)先去除最外層膜及靜脈跟動(dòng)脈后剪碎以充 分與培養(yǎng)基接觸。在一些具體實(shí)施例中，臍帶去除最外層膜及靜脈跟動(dòng)脈后剪至大小為 1mm 3~3mm 3的小塊，以0. 5cm~lcm的間隔把組織塊分布于培養(yǎng)皿中。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)前完全培養(yǎng)基的加入量為0. 07mL/cm2-0. lmL/cm2。
[0023] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，在培養(yǎng)期間需要補(bǔ)加完全培養(yǎng)基直至組織塊有細(xì)胞爬 出。在一些具體實(shí)施例中，所述培養(yǎng)期間補(bǔ)加完全培養(yǎng)基的加入量為〇. 〇7mL/cm2-〇. lmL/ cm2。
[0024] 本發(fā)明所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中，在組織塊有細(xì)胞爬出后 去掉組織塊，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。
[0025] 本發(fā)明所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中，在清洗后加入完全培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到80 %~90 %。在一些實(shí)施方案中，所述清洗后完全培養(yǎng)基 的加入量為 〇? 15mL/cm2-〇. 21mL/cm2。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中，所述 終止消化的完全培養(yǎng)基的加入量為消化液體積的5倍~10倍。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述P1代間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法中所述 離心為200g_400g離心5min。
[0028] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，比較H)GF、EGF不同添加方式的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì) 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)變化及細(xì)胞總數(shù)的影響，結(jié)果顯示EGF、TOGF聯(lián)合使用的細(xì)胞在形態(tài)上 較好，為梭形、成纖維狀，形態(tài)也較均一。而沒(méi)有加入EGF、TOGF的細(xì)胞密度比較稀疏，形態(tài) 上有較大的改變，部分細(xì)胞已經(jīng)開始出現(xiàn)分化現(xiàn)象。且EGF、PDGF聯(lián)合使用可明顯促進(jìn)臍帶 MSC的增殖。EGF、PDGF兩個(gè)聯(lián)合使用的濃度，在較低濃度范圍（5 y g/L~10 y g/L)均可達(dá) 到較好的促增殖效果，將EGF、PDGF的濃度由5 y g/L提高到10 y g/L之后，所起到的促進(jìn)增 殖的作用并沒(méi)有明顯的差異，而在細(xì)胞形態(tài)上，也無(wú)明顯差別，均為梭形、成纖維狀細(xì)胞，狀 態(tài)都較好。表明低濃度的EGF及TOGF聯(lián)合使用，不僅可以促進(jìn)臍帶MSC的增殖，而且可抑 制該細(xì)胞在體外培養(yǎng)的分化。
[0029] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，考察本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法培養(yǎng)的間 充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，由細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖可知本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方 法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞〇~2天為適應(yīng)期，3~6天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)