葡萄糖苷酶CcBgllA分別在30、35、40、45、50°0保溫111后， 其殘余酶活力分別為95%、21%、6%、1. 2%、0. 2% (圖6中d)。
[0107] 實(shí)施例4、用重組葡萄糖苷酶CcBgllA制備人參二醇型皂苷Gyp XVII、 compound 0、Mb 和 F2
[0108] 1、人參二醇型皂苷PPDGM各組分及其含量的檢測(cè)
[0109] 本實(shí)施例利用實(shí)施例2步驟3純化得到的重組0 -葡萄糖苷酶CcBgllA以人參二 醇型皂苷PPDGM為底物制備人參二醇型皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2。其中，人參 二醇型皂苷PPDGM按照文獻(xiàn)（《番茄葉霉病原菌轉(zhuǎn)化人參皂甙的研宄》，王娟，東北師范大學(xué) 碩士學(xué)位論文）的方法，從干燥人參根中提取得到。該人參二醇型皂苷PPDGM的各組分及 所占百分比分別為：Rbl:37. 8% ;Rb2:17. 1% ;Rc:24. 3% ;Rd:9. 5%。檢測(cè)人參二醇型皂 苷PPDGM各組分及其含量的方法為HPLC-C18反相柱法，方法如下所述：
[0110] 色譜柱：Shim-pack PREP-ODS(H)反相柱（250X4. 6mm, 5 ym)
[0111] 上樣量：20yl
[0112] 流動(dòng)相：A:水；B:乙腈
[0113] 程序：0-10min，32% B，68% A;10-40min(不包括 10min)，B 的體積百分含量 由32%勻速增加到60%，A的體積百分含量由68%勻速降低到40% ;40-50min(不包括 40min) ,60% B,40% A [0114]柱溫：25°C
[0115] 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，203nm
[0116]流速：1.0mL/min
[0117] 其中，標(biāo)準(zhǔn)品分別為人參皂苷詘1，詘2，此，1?(1，67口乂￥11，(3〇11^〇1111(10，]\&和？2(國 家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源網(wǎng)，商品目錄號(hào)分別為RblSS0769 ;Rb2SS0770 ;Rc SS0767 ;Rd SS0768 ;Gyp XVII A0638;F2SG_G021;compound 0 和 Mb 為按照文獻(xiàn)（Efficient biotransformation for preparation of pharmaceutically active ginsenoside Compound K by Penicillium oxalicum sp.68.Annals of Microbiology, 63, 139-149,2013)制備并鑒 定）。
[0118] 2、用重組0-糖苷水解酶CcBgllA制備人參皂苷Gyp XVII，compound 0,Mb和F2
[0119] 用重組0-糖苷水解酶CcBgllA制備人參皂苷Gyp XVII，compound 0,Mb和F2實(shí) 驗(yàn)重復(fù)三次，每次實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：
[0120] 將實(shí)施例2步驟3純化得到的重組0 -糖苷水解酶CcBgl 1A用50mM NaAc緩沖液 (pH 5. 5)調(diào)整蛋白濃度為lmg/ml (即32IU/ml)的酶液，在100ml上述酶液中加入2. 5g人 參二醇型皂苷PPDGM，使其終濃度為25mg/ml，30°C、lOOrprn攪拌條件下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束 后，80°C加熱10min使酶失活，離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20ml，-70°C預(yù)凍后，冷凍干燥得到 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物干燥粉。按照本實(shí)施例上述HPLC-C18反相柱法以人參皂苷Gyp XVII，compound 0，Mb和F2(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源網(wǎng)，商品目錄號(hào)分別為Gyp XVII A0638;F2SG-G021; compound 0 和 Mb 為按照文獻(xiàn)(Efficient biotransformation for preparation of pharmaceutically active ginsenoside Compound K by Penicillium oxalicum sp. 68. Annals of Microbiology, 63, 139-149, 2013)制備并鑒定）為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性和采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法）進(jìn)行定量分析（圖4)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化產(chǎn) 物中的人參皂苷 Gyp XVII，compound 0,Mb 和 F2 含量分別為 35%、16.5%、23. 9%、8. 9% (質(zhì)量百分含量）。
[0121] 將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物干燥粉溶于少量由體積比為65:35:10 (v/v/v，下層）的氯仿、甲醇和 水組成的液體中，上樣至100mL硅膠柱層析。用由體積比為65:35:10( v/v/v，下層）的氯 仿、甲醇和水組成的液體進(jìn)行洗脫，分別收集含有人參皂苷Gyp XVII，compound 0,Mb和F2 的級(jí)分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無有機(jī)溶劑流出，_70°C預(yù)凍后分別冷凍干燥，得到人參皂苷Gyp XVII， compound 0, Mb和F2純品。所述的人參阜苷Gyp XVII，compound 0, Mb和F2純品經(jīng)上述 HPLC分析結(jié)果表明含量均超過95%。結(jié)果表明該2. 5g人參二醇型皂苷PPDGM分別得到 人參皂苷 Gyp XVII，compound 0, Mb 和 F2 純品 0? 75±0. lg、0. 35±0. 05g、0. 46±0. 05g、 0? 20±0.04g，人參皂苷 Gyp XVII，compound 0,Mb 和 F2 的產(chǎn)率分別為 30%、14%、18. 4%、 8% (各人參皂苷產(chǎn)量/投料PPDGM量*100% )。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備人參皂苷GypXVII、C〇mp〇und0、Mb和F2的方法，包括以人參二醇型皂苷為底 物用蛋白質(zhì)進(jìn)行催化反應(yīng)得到含有人參皂苷GypXVII、compound0、Mb和F2反應(yīng)物的步 驟，所述蛋白質(zhì)，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)： a) 氨基酸序列是SEQIDNo. 2的蛋白質(zhì)； b) 氨基酸序列是SEQIDNo. 4的蛋白質(zhì)； c) 將SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有人參皂苷水解酶活性的蛋白質(zhì)； d) 將SEQIDNo. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有人參皂苷水解酶活性的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括從所述反應(yīng)物中純化得到 人參皂苷GypXVII、compound0、Mb和F2的步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述以人參二醇型皂苷為底物用蛋 白質(zhì)進(jìn)行催化反應(yīng)在液體中進(jìn)行，所述液體中所述蛋白質(zhì)和所述人參二醇型皂苷的配比為 IIU所述蛋白質(zhì)：0.5-2mg所述人參二醇型皂苷，所述IU為所述蛋白質(zhì)的0-糖苷水解酶酶 活。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述催化反應(yīng)進(jìn)行1-3小時(shí)，所述 催化反應(yīng)在25-35 °C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述純化包括以下步驟：將所述反 應(yīng)物進(jìn)行離心，使人參皂苷GypXVII、compound0、Mb和F2進(jìn)入上清液中，收集上清液，得 到含有人參皂苷GypXVIIcompound0、Mb和F2的上清液，將所述上清液干燥，得到含有人 參皂苷GypXVII、c〇mp〇und0、Mb和F2的干燥粉，除去所述干燥粉中的雜質(zhì)，分別得到人參 阜苷GypXVII、compound0、Mb和F2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：除去所述干燥粉中的雜質(zhì)包括以 下步驟：將所述干燥粉溶于溶液A中，得到含有人參皂苷GypXVII、compound0、Mb和F2 的液體混合物，將所述液體混合物進(jìn)行硅膠柱層析，用所述溶液A洗脫，分別收集含有人參 皂苷GypXVII、c〇mp〇und0、Mb和F2的級(jí)分，將各所述級(jí)分干燥，得到人參皂苷GypXVII、 compound0、Mb和F2 ; 所述溶液A由氯仿、甲醇和水組成，所述溶液A中氯仿、甲醇和水的體積比為 65:35:10 (下層溶液）。
7. 權(quán)利要求1所述方法中的所述蛋白質(zhì)在制備人參阜苷Gyp XVII、compound 0、Mb和 F2中的應(yīng)用。
8. 與權(quán)利要求1所述方法中的所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料在制備人參皂苷Gyp XVII、 compound 0、Mb和F2中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述方法中的所述蛋白質(zhì)在催化人參皂苷制備人參皂苷Gyp XVII、 compound 0、Mb和F2中的應(yīng)用。
10. 與權(quán)利要求1所述方法中的所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料在催化人參皂苷制備人參 皂苷 Gyp XVII、compound 0、Mb 和 F2 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備人參皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法。本發(fā)明所提供的制備人參皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法，包括以人參二醇型皂苷為底物用蛋白質(zhì)進(jìn)行催化反應(yīng)得到含有人參皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2反應(yīng)物的步驟，所述蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的蛋白質(zhì)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有人參皂苷水解酶活性的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的制備人參皂苷Gyp XVII、compound O、Mb和F2的方法具有較強(qiáng)的實(shí)用性。CGMCC No.758720130514
【IPC分類】C12P33-20, C12N9-24
【公開號(hào)】CN104762280
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510036363
【發(fā)明人】周義發(fā), 高娟, 原野, 胡彥波, 孫成新, 陳紅磊, 胡晨星
【申請(qǐng)人】東北師范大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年1月25日