量為8000道爾頓-14000道爾頓的透析袋，對三種不同的蛋白酶透析，得到最終的蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3 ;其中，SephadexG-1OO凝膠分離條件為:樣品濃度5mg/mL，上樣量為lmL，蒸飽水為洗脫液，洗脫流速為1.5mL/min，檢測波長為280nm。
[0063]實(shí)施例2
[0064]步驟1:將新鮮金鯧魚的內(nèi)臟洗干凈并切成段，按照固液體積比1:3的比例將內(nèi)臟放在4°C的丙酮中脫脂15min，去除脂肪，脫脂結(jié)束后用4°C的蒸餾水洗干凈內(nèi)臟上的丙酮；然后將脫脂后的內(nèi)臟加入到4倍體積的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，用打漿機(jī)將其充分打碎后在4°C條件下浸提2小時(shí)；最后在4°C，15000rpm下離心20min，取上清液，上清液即為蛋白酶粗酶液；
[0065]步驟2:采用硫酸銨對蛋白酶粗酶液進(jìn)行粗分離得到復(fù)合蛋白酶液，首先將硫酸銨研磨成細(xì)粉末，分別加入到蛋白酶粗酶液中至以下質(zhì)量分?jǐn)?shù):25 %、35 %、45 %、55 %、65 %，鹽析得到粗復(fù)合蛋白酶液；然后以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)底物，利用紫外分光光度法測定不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)下鹽析得到的粗復(fù)合蛋白酶液的酶的活性，選取活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液；測試結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，鹽析得到的復(fù)合蛋白酶的活性最高，因此，選取硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)鹽析得到的復(fù)合蛋白酶液進(jìn)行后續(xù)蛋白酶的進(jìn)一步提取；將得到的活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液在4°C條件下靜置2小時(shí)，然后于4°C、12500r/min下離心15min，丟棄上清液，沉淀用1/4原蛋白酶粗酶液體積的pH7.5的Tris-Hcl緩沖溶液溶解，然后在4°C條件下，以蒸餾水為透析外液在磁力攪拌下透析36h，期間換蒸餾水多次，透析袋中的液體即為復(fù)合蛋白酶液；
[0066]步驟3:采用SephadexG-1OO凝膠分離步驟2得到的復(fù)合蛋白酶液，分別收集每個(gè)峰的洗脫組分，得到三種不同的蛋白酶，分別用透過分子量為8000道爾頓-14000道爾頓的透析袋，對三種不同的蛋白酶透析，得到最終的蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3 ;其中，SephadexG-1OO凝膠分離條件為:樣品濃度10mg/mL，上樣量為2mL，蒸飽水為洗脫液，洗脫流速為2mL/min，檢測波長為280nm。
[0067]實(shí)施例3
[0068]步驟1:將新鮮金鯧魚的內(nèi)臟洗干凈并切成段，按照固液體積比1:2.5的比例將內(nèi)臟放在4°C的丙酮中脫脂20min，去除脂肪，脫脂結(jié)束后用4°C的蒸餾水洗干凈內(nèi)臟上的丙酮；然后將脫脂后的內(nèi)臟加入到5倍體積的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，用打漿機(jī)將其充分打碎后在4°C條件下浸提5小時(shí)；最后在4°C，20000rpm下離心30min，取上清液，上清液即為蛋白酶粗酶液；
[0069]步驟2:采用硫酸銨對蛋白酶粗酶液進(jìn)行粗分離得到復(fù)合蛋白酶液，首先將硫酸銨研磨成細(xì)粉末，分別加入到蛋白酶粗酶液中至以下質(zhì)量分?jǐn)?shù):25 %、35 %、45 %、55 %、65 %，鹽析得到粗復(fù)合蛋白酶液；然后以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)底物，利用紫外分光光度法測定不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)下鹽析得到的粗復(fù)合蛋白酶液的酶的活性，選取活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液；測試結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，鹽析得到的復(fù)合蛋白酶的活性最高，因此，選取硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)鹽析得到的復(fù)合蛋白酶液進(jìn)行后續(xù)蛋白酶的進(jìn)一步提取；將得到的活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液在4°C條件下靜置5小時(shí)，然后于4°C、15000r/min下離心20min，丟棄上清液，沉淀用1/5原蛋白酶粗酶液體積的pH7.5的Tris-Hcl緩沖溶液溶解，然后在4°C條件下，以蒸餾水為透析外液在磁力攪拌下透析48h，期間換蒸餾水多次，透析袋中的液體即為復(fù)合蛋白酶液；
[0070]步驟3:采用SephadexG-1OO凝膠分離步驟2得到的復(fù)合蛋白酶液，分別收集每個(gè)峰的洗脫組分，得到三種不同的蛋白酶，記分別用透過分子量為8000道爾頓-14000道爾頓的透析袋，對三種不同的蛋白酶透析，得到最終的蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3 ;其中，SephadexG-1OO凝膠分離條件為:樣品濃度20mg/mL，上樣量為L 5mL，蒸餾水為洗脫液，洗脫流速為2mL/min，檢測波長為280nm。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行: 步驟1:對新鮮金鯧魚的內(nèi)臟脫脂、浸提、離心后得到蛋白酶粗酶液； 步驟2:采用硫酸銨對蛋白酶粗酶液進(jìn)行粗分離得到復(fù)合蛋白酶液； 步驟3:采用SephadexG-ΙΟΟ凝膠分離步驟2得到的復(fù)合蛋白酶液，得到三種不同的蛋白酶，根據(jù)出峰時(shí)間依次記為:蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，其特征在于，所述步驟I的具體過程為: 將洗干凈的新鮮金鯧魚的內(nèi)臟切成段，按照固液體積比1:2-3的比例將內(nèi)臟放在4°C的丙酮中脫脂10-20min，去除脂肪，脫脂結(jié)束后用4°C的蒸餾水洗干凈內(nèi)臟上的丙酮； 然后將脫脂后的內(nèi)臟加入到3-5倍體積的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，用打漿機(jī)將其充分打碎后在4°C條件下浸提2-5小時(shí)； 最后在4°C，10000-20000rpm下離心15_30min，取上清液，上清液即為蛋白酶粗酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，其特征在于，所述步驟2的具體過程為: 2.1，首先將硫酸銨研磨成細(xì)粉末，分別加入到蛋白酶粗酶液中至以下質(zhì)量分?jǐn)?shù):25%、35%,45%,55%,65%,鹽析得到粗復(fù)合蛋白酶液； 2.2，然后以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)底物，利用紫外分光光度法測定不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)下鹽析得到的粗復(fù)合蛋白酶液的酶活性，選取活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液； 2.3，將步驟2.2得到的活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液在4°C條件下靜置2-5小時(shí)，然后于4°C、10000-15000r/min下離心10_20min，丟棄上清液，沉淀用1/5-1/4蛋白酶粗酶液體積的PH7.5的Tris-Hcl緩沖溶液溶解，然后在4°C條件下，以蒸餾水為透析外液在磁力攪拌下透析24-48h，期間換蒸餾水多次，透析袋中的液體即為復(fù)合蛋白酶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，其特征在于，所述步驟3的具體過程為: 將復(fù)合蛋白酶液用SephadexG-ΙΟΟ凝膠進(jìn)行分離，分別收集每個(gè)峰的洗脫組分，得到三種不同的蛋白酶，分別用透過分子量為8000道爾頓-14000道爾頓的透析袋，對三種不同的蛋白酶透析，得到最終的蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3 ;其中，SephadexG-ΙΟΟ凝膠分離條件為:樣品濃度5_20mg/mL，上樣量為l_2mL，蒸餾水為洗脫液，洗脫流速為1.5-2.0mL/min，檢測波長為280nmo
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項(xiàng)所述的金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶的分離方法制備的蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白酶在分解明膠上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶的分離方法、蛋白酶及其應(yīng)用，包括對新鮮金鯧魚的內(nèi)臟脫脂、浸提、離心后得到蛋白酶粗酶液，然后采用硫酸銨對蛋白酶粗酶液進(jìn)行粗分離得到復(fù)合蛋白酶液，最后采用SephadexG-100凝膠分離步驟2得到的復(fù)合蛋白酶液得到三種不同的蛋白酶，記為蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3。本發(fā)明方法充分利用金鯧魚加工過程中的生產(chǎn)殘?jiān)?，在金鯧魚內(nèi)臟中提取到了明膠降解能力強(qiáng)且專一的蛋白酶，為分解明膠的蛋白酶提取開辟了新的途徑，提高額金鯧魚的利用率，實(shí)現(xiàn)了金鯧魚的高附加值利用。此外，本發(fā)明方法原料成本低，生產(chǎn)工藝簡單。
【IPC分類】C12N9-64, C12P21-06
【公開號】CN104762283
【申請?zhí)枴緾N201510195823
【發(fā)明人】申鉉日, 肖鑫鑫
【申請人】海南大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月23日