微孔膜滲透乳化制備固定醇脫氫酶的明膠微球的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微孔膜滲透乳化制備明膠微球的方法，屬于固定化酶的明膠微球
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 明膠微球是一種常用的固定化酶載體。明膠是動物膠原蛋白部分水解的產(chǎn)物，是 由18種氨基酸與多肽交聯(lián)形成的直鏈聚合物。明膠無毒、幾乎無抗原性，生物降解性和生 物相容性好，價格便宜，是一種非常適宜制備微球的天然高分子材料。明膠微球也廣泛應(yīng)用 于制備栓塞劑、藥物載體、組織修復等，同時也可作模板劑制備各種具有高級結(jié)構(gòu)的材料。
[0003] 現(xiàn)有的制備固定醇脫氫酶的明膠微球的技術(shù)方法包括： 名為《明膠載體固定化乙醇脫氫酶技術(shù)研宄》的論文（《中國釀造》2010年11期第50-51 頁，作者毛跟年、李鑫、郭倩、瞿建波、李麗維等）公開了一種制備顆粒明膠載體固定化乙醇 脫氫酶的方法，具體過程包括：配制15%的明膠溶液，70°C水浴至明膠完全溶解，倒入平板， 冷卻后放置冰箱過夜，切塊粉碎成明膠顆粒，與4%戊二醛溶液交聯(lián)2h，稱取lg明膠顆粒，按 1 : l(m/v)的比例與酶液混合，25°C振蕩反應(yīng)2.5h，取出用蒸餾水洗滌數(shù)次，即得明膠固定 化醇脫氫酶載體。此方法雖然使固定化醇脫氫酶的活力在使用10個循環(huán)后維持在52. 89%， 但是依靠機械粉碎獲得的明膠顆粒粒徑過大、球形度不好，同時載體過大會造成醇脫氫酶 與底物接觸困難，催化反應(yīng)速率較低。
[0004][0005] 名為《Biomimetic polymer-inorganic hybrid microcapsules for yeast alcohol dehydrogenase encapsulation〉〉的論文（〈〈Reactive and Functional Polymers)) 2008 年 11 期第 1507-1515 頁，作者 Lei Zhang、Yanjun Jiang、Jiafu Shi、Xiaohui Sun、 Jian Li、Zhongyi Jiang等）公開了一種制備海藻酸媽-明膠復合凝膠載體固定化醇脫氫 酶的方法，具體過程包括：將海藻酸鈉固體和醇脫氫酶固定一同溶解于去離子水，得到海藻 酸鈉/醇脫氫酶溶液，其中海藻酸鈉質(zhì)量體積濃度2%w/v、醇脫氫酶質(zhì)量濃度為0. 24毫克/ 毫升。另外將明膠固體與氯化鈣固定共溶解于去離子水，配制成明膠/氯化鈣溶液，其中明 膠質(zhì)量體積濃度為1%?八，氯化鈣摩爾濃度為〇. 1摩爾/升。將海藻酸鈉/醇脫氫酶溶液用 注射器滴加入明膠/氯化鈣溶液中，海藻酸鈉/醇脫氫酶溶液液滴經(jīng)固化10分鐘后，得到 固定化醇脫氫酶的海藻酸鈣/明膠復合凝膠球。此方法將固定化醇脫氫酶的微球粒徑減小 至1-2毫米，循環(huán)使用和儲存穩(wěn)定性都有所提高，但是顆粒粒徑依然較大、催化反應(yīng)速率較 低。同時醇脫氫酶主要存在于海藻酸鈣凝膠中，明膠處于外層，未對醇脫氫酶產(chǎn)生有效的保 護。
[0006] 作為固定化酶材料或藥物載體的明膠微球大多采用攪拌乳化法制備。此類方法雖 然可獲得球形度良好的微球，但是攪拌法常存在著微球粒徑不均一、難以控制、需要大量后 續(xù)篩分處理的問題。中國專利號CN103393606A的發(fā)明專利提供了一種包封仙人掌多糖的 明膠微球制備工藝。其制備方法為：首先取少許明膠溶于適量水中，再加入野生仙人掌多糖 溶液，充分混勻經(jīng)初乳化制成水相溶液；油相連續(xù)相為液體石蠟，添加少量吐溫-80為乳化 劑；在保持原有穩(wěn)定的條件下，將明膠多糖水相緩緩加入液體石蠟并充分攪拌，充分乳化后 迅速冷卻5°C下并保持攪拌，加入戊二醛固化2小時；最后離心，取沉淀用異丙醇或乙醇洗 去殘留油質(zhì)和戊二醛，凍干得到微球。此法所得微球粒度分布較寬，且未用于固定化醇脫氫 酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種微孔膜滲透乳化制備固定醇脫氫酶的明膠微球的方 法。以該方法所制得的固定醇脫氫酶的明膠微球的粒度均一、大小可控，儲存穩(wěn)定性好，使 用過程醇脫氫酶的泄漏率低，耐酸堿環(huán)境能力強。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案加以實現(xiàn)的，一種微孔膜滲透乳化制備固定醇脫氫酶 的明膠微球的方法，該方法采用包括微孔膜組件的裝置加以實現(xiàn)的，其特征在于包括以下 步驟： 1) 在容器中，于溫度為40°C -70°C及攪拌下將固體明膠溶解于去離子水中，配制成 濃度為〇. 05-0. 5克/毫升的明膠溶液，按明膠溶液中的明膠與醇脫氫酶的質(zhì)量比為100 : (〇. 2~2)再向明膠溶液中加入醇脫氫酶溶解，得到明膠/醇脫氫酶溶液，稱為水相； 2) 在容器中，于溫度為40°C -70°C及攪拌下將油溶性乳化劑司班-80加入到液體石蠟 中，司班-80質(zhì)量為液體石蠟質(zhì)量的0. 25-4. 0%，混合均勻的液體石蠟油，稱為油相； 3) 將膜孔徑為3. 5-10. 2微米的管狀微孔膜浸潤于油相中，按步驟1)制的水相與步驟 2)制的油相的體積比為1: (2~15)，在溫度40°C -70°C及以5kPa-50kPa壓力下，將水相加 入膜乳化裝置中的管狀微孔膜腔內(nèi)，由管狀微孔膜的膜孔滲透的水相液滴進入油相，乳化 形成W/0型乳液； 4) 將步驟3)制得的W/0型乳液磁力攪拌5-30分鐘后，移置于0°C _8°C冰水浴中，按照 每克明膠加入lmL戊二醛的標準，加入交聯(lián)劑戊二醛0. 5mL-5mL，交聯(lián)固化0. 5-4小時后，分 別用異丙醇和丙酮進行洗滌至無油相組分為止，然后在空氣中自然干燥得到固定醇脫氫酶 的明膠微球。
[0009] 本發(fā)明提出的制備方法的優(yōu)點在于：制備條件溫和，制備工藝簡單易行，固定醇脫 氫酶的明膠微球粒度均一，且可通過采用不同膜孔徑的微孔膜達到控制固定醇脫氫酶的明 膠微球粒徑的目的，粒徑可控在20-90 y m范圍內(nèi)，醇脫氫酶固定的能力強，對酸堿耐受性 能優(yōu)良，儲存穩(wěn)定性好。
【附圖說明】
[0010] 圖1為實現(xiàn)本方法的裝置示意圖 圖中：（1)為管狀微孔膜，（2)為壓力氣體通入管路，（3)為盛放明膠/醇脫氫酶的儲 罐，（4)為盛放液體石蠟油的燒杯，（5)為磁力攪拌器，（6)為明膠/醇脫氫酶溶液，（7)為 液體石蠟油。
[0011] 圖2為實施例1制得的固定醇脫氫酶的明膠微球的掃描電鏡（SEM)照片。
[0012] 圖3為對比例1制得的固定醇脫氫酶的明膠微球的掃描電鏡（SEM)照片。
[0013] 對照圖2和圖3能明顯看出本發(fā)明方法制得的固定醇脫氫酶的明膠微球的粒度非 常均一。
[0014] 圖4為根據(jù)采用不同尺寸膜孔徑的微孔膜制得粒徑不同尺寸的固定醇脫氫酶的 明膠微球數(shù)據(jù)，繪制的膜孔徑與微球粒徑尺寸的對應(yīng)關(guān)系線圖。
[0015] 數(shù)據(jù)來自實施例1-3。
[0016] 圖5為實施例1和對比例1中制備的明膠微球固定化的醇脫氫酶在不同pH值下 相對酶活力變化圖。
[0017] 圖6為實施例1和對比例1中制備的明膠微球固定醇脫氫酶在儲存不同天數(shù)后相 對酶活力變化圖。
【具體實施方式】
[0018] 為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施 例僅僅是為了幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。
[0019] 實施例1 膜乳化法制備固定醇脫氫酶的明膠微球： 在以200轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌和溫度55°C條件下，向10毫升水中加入1克明膠干粉，維 持此速度下磁力攪拌〇. 5小時，至明膠干粉完全溶解于水中，溶解后明膠濃度為0. 1克/毫 升，向該明膠溶液中加入醇脫氫酶1毫克，溶解后醇脫氫酶濃度為〇. 1毫克/毫升。以上述 明膠/醇脫氫酶水溶液作為水相。
[0020] 將油溶性乳化劑司班-80加入到60毫升的液體石蠟中，司班-80質(zhì)量為液體石蠟 質(zhì)量的1. 5%。以200轉(zhuǎn)/分鐘速度磁力攪拌30分鐘，至司班-80完全溶解，并將上述溶液 加熱至60°C作為油相。
[0021] 膜乳化過程：采用管狀Shirasu Porous Glass微孔膜（SPG微孔膜)。膜管直徑為 1厘米，長度為2厘米，膜孔徑為3. 5微米。使用前需要預先將微孔膜浸潤于在預熱至60°C 的液體石蠟中30分鐘，然后將微孔膜裝入膜乳化裝置中，膜乳化裝置結(jié)構(gòu)見附圖1?？焖賹?上述制備好的水相明膠/醇脫氫酶溶液加入膜乳化裝置，通入氮氣，在5kPa壓力下使水相 溶液通過微孔膜進入磁力攪拌的60°C油相中，得到液滴均勻的W/0型乳液，攪拌速度為400 轉(zhuǎn)/分鐘。將所得乳液繼續(xù)在400轉(zhuǎn)/分鐘下磁力攪拌15分鐘后，迅速置于4°C冰水浴中， 加入交聯(lián)劑戊二醛lmL，交聯(lián)固化2小時。結(jié)束后，分別用異丙醇和丙酮進行洗滌至油相組 分完全去除，然后在空氣中自然干燥得到固定醇脫氫酶的明膠微球。微球的平均粒徑和粒 徑分布采用激光粒度儀Mastersizer2000進行測量，固定醇脫氫酶的明膠微球的粒徑及分 布見表1。
[0022] 對上述過程制得的固定醇脫氫酶的明膠微球在不同pH下的相對酶活力進行測 定： 將甲醛和還原型輔酶I二鈉加到0. 05mol/L、不同pH值的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩 沖液中，配成甲醛濃度為10mm〇l/L，還原型輔酶I二鈉濃度為133ymol/L，加入制備的固 定化醇脫氫酶的明膠微球，在25°C、攪拌的條件下進行甲醛轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用紫外-可見分光光 度計測定還原型輔酶I二鈉的轉(zhuǎn)化量，得到固定醇脫氫酶的活力，并以最高酶活力對應(yīng)的 pH值為最適pH值，將最適pH值下相對酶活力定義為100%。
[0023] 將其他pH值下的醇脫氫酶活力與最適pH值下的醇脫氫酶活力對比，得到最適pH 值為7. 0，pH7. 0時固定醇脫氫酶明膠微球的相對酶活力為100%。與最適pH值條件下相比， pH4. 0時固定醇脫氫酶明膠微球的相對酶活力為68. 3% ;pH5. 0時固定醇脫氫酶明膠微球的 相對酶活力為92. 0% ;pH6. 0時固定醇脫氫酶明膠微球的相對酶活力為96. 8% ; pH8. 0時固 定醇脫氫酶明膠微球的相對酶活力為76. 2% ;pH9. 0時固定醇脫氫酶明膠微球的相對酶活 力為52. 7% ;pH10. 0時固定醇脫氫酶明膠微球的相對酶活力為44. 4%。
[0024] 對上述過程制得的固定化醇脫氫酶的明膠微球中醇脫氫酶的儲存穩(wěn)定性進行測 定： 將甲醛和還