高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌誘變菌株的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶學(xué)和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌誘變菌株的制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2014年全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量338萬噸，中國仍為全球主要對蝦生產(chǎn)國，養(yǎng)殖產(chǎn)量130.3萬噸。養(yǎng)殖品種以凡納濱對蝦為主，占養(yǎng)殖總量的73%，其余養(yǎng)殖品種斑節(jié)對蝦、中國對好和日本對好各占7%、6%和6%。各品種區(qū)域分布明顯，凡納濱對好覆蓋全國，中國對蝦集中在山東、河北及江蘇等地，日本對蝦在山東、河北養(yǎng)殖較多，斑節(jié)對蝦廣東養(yǎng)殖較多。對蝦的消耗有三個途徑，一是出口，主要為去頭蝦，二是鮮蝦食用，三是加工蝦仁內(nèi)銷。無論哪種途徑，均會產(chǎn)生大量的蝦頭、蝦殼及蝦尾廢棄物，約占整蝦的20%?50%，這些廢棄物中含有大量的甲殼素及蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、蝦青素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，甲殼素可以脫乙?；D(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸嘀毓δ艿臍ぞ厶?，但目前生產(chǎn)上對蝦廢棄物的利用是采用酸堿法提取甲殼素，剩余的營養(yǎng)成分隨著廢液排到環(huán)境中，既加劇了環(huán)境污染，又造成了資源的巨大浪費(fèi)，制約著對蝦加工業(yè)的發(fā)展，因此如何科學(xué)地綠色環(huán)保地利用對蝦蝦頭、蝦殼，提高經(jīng)濟(jì)附加值，成為目前我國亟待解決的科學(xué)問題。
[0003]我們前期研宄表明，對蝦加工廢棄物經(jīng)過乳酸菌脫鈣和枯草芽孢桿菌脫蛋白，生產(chǎn)出了綠色安全甲殼素和復(fù)合蛋白粉，具有很大的開發(fā)利用價(jià)值，且研宄所用枯草芽孢桿菌分離純化于對蝦養(yǎng)殖池塘，產(chǎn)生的蛋白酶活力強(qiáng)，針對性好，效果明顯，在此基礎(chǔ)上，我們采用等離子體和紫外誘變相結(jié)合的方法，誘變分離的枯草芽孢桿菌，制備高產(chǎn)蛋白酶菌株，用于對蝦加工廢棄物的高值化利用上，取得了顯著的處理效果。
[0004]通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下I篇與本專利申請相關(guān)的公開專利文獻(xiàn):1、本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法(CN201210560999)，經(jīng)過菌株的處理與富集，菌株的初步篩選和菌株的復(fù)篩得到高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌。該方法對高產(chǎn)蛋白酶菌株選擇性強(qiáng)；篩選過程采用混合篩選，效率高；方法科學(xué)、時(shí)間周期短。通過比對，上述公開專利文獻(xiàn)的技術(shù)方案及提取客體均與本專利申請有本質(zhì)的不同，本專利申請具有新穎性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌誘變菌株的制備及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種尚廣蛋白酶的枯草芽抱桿菌誘變菌株的制備，包括步驟如下:
[0008](I)枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株的獲得，枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株由對蝦養(yǎng)殖池塘底部沉積物中篩選獲得；
[0009](2)枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株的培養(yǎng)、誘變及初步篩選，枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株接種到培養(yǎng)基中，發(fā)酵6h、離心，沉淀用無菌生理鹽水洗滌，稀釋5倍后測600nm處OD值0.6-0.8，取10 μ I稀釋后的菌液加到特制金屬片上，利用常壓室溫等離子體育種機(jī)進(jìn)行菌株誘變；誘變后，將樣品載片取出，置裝有Iml滅菌生理鹽水的離心管中，振蕩菌體，使其徹底懸浮于生理鹽水中，用生理鹽水稀釋，取100 μ I涂布于篩選平板上，根據(jù)菌落產(chǎn)生的圈徑比，初步篩選等離子體誘變平板上的正突變菌株；
[0010](3)篩選出酶活較高的菌株，分別將初篩的菌株和原始菌株接種于培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按I %的接種量轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，15h，12000r/min離心3min，上清即為粗酶液，篩選出酶活較高的菌株；
[0011](4)篩選高酶活菌株，將篩選出的較高酶活菌株接種到平板上，紫外燈下照射時(shí)間5-10s，再重復(fù)以上過程，篩選高酶活菌株；
[0012](5)對篩選獲得的正突變株連續(xù)搖瓶發(fā)酵傳代10次，最終所得菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。
[0013]而且，所述步驟(2)中培養(yǎng)基為:g/L，葡萄糖20.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5.0、牛肉膏 5.00
[0014]而且，所述步驟(2)中發(fā)酵的溫度為:25_35°C。
[0015]而且，所述步驟(2)中菌株誘變的誘變條件為:電源功率為115W，工作氣流量為10L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2mm，氦氣作為工作氣體，照射時(shí)間為20_40s，紫外燈照射時(shí)間5-lOs。
[0016]而且，所述步驟(5)中紫外燈下最優(yōu)照射時(shí)間為8s。
[0017]一種高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌誘變菌株的應(yīng)用，其特征在于:將上述篩選所得枯草芽孢桿菌誘變菌株用于處理對蝦廢棄物。
[0018]而且，所述枯草芽孢桿菌誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶時(shí)最適pH6-6.5，最適溫度45-50。。。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0020]1、本發(fā)明采用的出發(fā)菌株來自對蝦養(yǎng)殖池塘，用其處理對蝦廢棄物，降解蛋白質(zhì)，針對性強(qiáng)，效果明顯。
[0021]2、本發(fā)明采用育種新技術(shù)中的等離子體技術(shù)，對于出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，又結(jié)合紫外照射，誘變成功率高，效果顯著，誘變菌株產(chǎn)生的蛋白酶活力顯著增加，既可以用于針對性處理對蝦廢棄物，又可以應(yīng)用在動物飼料行業(yè)，具有較好的應(yīng)用推廣前景。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023]實(shí)施例1
[0024]尚廣蛋白酶的枯草芽抱桿菌誘變菌株的制備，包括以下步驟:
[0025](I)枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株的獲得，枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株由對蝦養(yǎng)殖池塘底部沉積物中篩選獲得；
[0026](2)枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株的培養(yǎng)、誘變及初步篩選，枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株接種到培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)基為:g/L，葡萄糖20.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5.0、牛肉膏5.0 ;發(fā)酵6h，發(fā)酵溫度27V，離心，沉淀用無菌生理鹽水洗滌，稀釋5倍后測600nm處OD值(0.69)，取10 μ I稀釋后的菌液加到特制金屬片上，利用常壓室溫等離子體育種機(jī)(ARTP)進(jìn)行菌株誘變，照射時(shí)間30s，其中，出發(fā)菌株的誘變條件為:電源功率為115W，工作氣流量為10L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2mm，氦氣作為工作氣體，照射時(shí)間為20s，紫外燈照射時(shí)間5s。
[0027]誘變后，將樣品載片取出，置裝有Iml滅菌生理鹽水的離心管中，振蕩菌體，使其徹底懸浮于生理鹽水中，用生理鹽水稀釋，取100 μ I涂布于篩選平板上，根據(jù)菌落產(chǎn)生的圈徑比，初步篩選等離子體誘變平板上的正突變菌株；
[0028](3)篩選出酶活較高的菌株，分別將初篩的菌株和原