利用固定化酶微反應(yīng)器連續(xù)制備低聚果糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種利用微反應(yīng)器酶解菊粉連續(xù)制備低聚果 糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚果糖（Fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS)是一種天然活性物質(zhì)，低聚果糖又稱鹿 果低聚糖，是由2~9個果糖基通過0 (2-1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果多 糖混合物，甜度為蔗糖的0. 3-0. 6倍。其保持了蔗糖的純正甜味，又比蔗糖清爽；是具有調(diào) 節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進(jìn)鈣的吸收，調(diào)節(jié)血脂，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能的新型 甜味劑。低聚果糖被譽(yù)為繼抗生素時代后最具潛力的新一代添加劑一一促生物質(zhì)；在法國 被稱為原生素（PPE)，已在乳制品、乳酸菌飲料、固體飲料、糖果、餅干、面包、果凍、冷飲等多 種食品中應(yīng)用。
[0003] 工業(yè)化生產(chǎn)低聚果糖的方法有兩種。一是蔗糖經(jīng)果糖轉(zhuǎn)移酶催化制備，產(chǎn)物低聚 果糖為CFn型；二是利用菊粉酶定向水解菊糖制備，產(chǎn)物低聚果糖為CFn與Fn的混合型。 在果糖轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖制備低聚果糖中，反應(yīng)副產(chǎn)物葡萄糖是酶的抑制劑，轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)物 中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖僅占55~60%以下，且工藝復(fù)雜成本高。菊粉內(nèi)切酶 定向水解菊粉制備低聚果糖是一步單酶反應(yīng)，工藝簡單，產(chǎn)物中低聚果糖含量高達(dá)80%以 上。因此，以菊粉為原料酶法一步水解其中的菊糖制取低聚果糖，具有工藝簡單、轉(zhuǎn)化率高、 副產(chǎn)物少的特點(diǎn)。
[0004] 有研宄表明，蔗果四糖具有很強(qiáng)的抗自由基活性，對心血管疾病的預(yù)防和治療效 果明顯；相關(guān)文章于 2014年在 International Journal of Food Science and Technology 2014,49, 1500 - 1505 上發(fā)表，標(biāo)題是"In vitro anti-hydroxyl radical activity of the fruetooligosaccharides 1-kestose and nystose using spectroscopic and computational approaches''。
[0005] 菊粉內(nèi)切酶，主要來源于菊科植物組織，前者的底物專一性較強(qiáng)，僅用于菊粉。菊 粉內(nèi)切酶是一種菊粉水解酶，其作用特性為：從菊糖分子內(nèi)部隨機(jī)切斷糖苷鍵，其產(chǎn)物為 GFjP Fn等低聚果糖，n = 2~9。
[0006] 微反應(yīng)器是一種建立在連續(xù)流動基礎(chǔ)上的微管道式反應(yīng)器，其工藝流體的通道在 微米級別，用以替代傳統(tǒng)反應(yīng)器。由于其有較大的比表面積，傳質(zhì)傳熱效率高，停留時間分 布窄，反應(yīng)條件可精確控制，安全性高，易于放大，可連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)勢近年來備受關(guān)注。微反 應(yīng)器中常用的類型為微通道反應(yīng)器，可通過PDMS、PMMA、玻璃圓管等來制造。而通道的尺寸 和形狀可以通過CFD來進(jìn)行模擬。
[0007] 固定化酶有很多優(yōu)點(diǎn)，尤其是穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性在很多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng) 用。戊二醛等固定化方法有時會對酶活有嚴(yán)重的損失，比如阻塞活性中心，誘導(dǎo)構(gòu)象改變 等。隨著固定化技術(shù)的不斷深入，固定用的載體也隨之推陳出新，不再局限于用傳統(tǒng)的無機(jī) 材料或者多糖類材料為載體，而趨于選擇提高固定化酶性能的新型功能性材料為載體，比 如介孔材料，納米材料，磁性微球等等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用固定化酶微反應(yīng)器連續(xù)制備低聚果 糖的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的合成低聚果糖反應(yīng)強(qiáng)度低，不能連續(xù)化生產(chǎn)等問題，同 時實(shí)現(xiàn)低聚果糖的有序可控的生產(chǎn)模式。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種利用固定化酶微反應(yīng)器連續(xù)制備低聚果糖的方法，將菊粉內(nèi)切酶固定在微 反應(yīng)器中，將底物菊粉水溶液注入到微反應(yīng)器中，底物流速為0. 1-lmL/min，反應(yīng)溫度為 55-65°C，反應(yīng)料液在微反應(yīng)器中循環(huán)連續(xù)流動的保留時間為2~6h，使菊粉溶液降解為低 聚果糖。
[0011] 其中，所述的底物菊粉水溶液，溶液pH值為3. 5-5. 5 (優(yōu)選pH4. 6)，溶質(zhì)菊粉的濃 度為 5_30wt%。
[0012] 其中，所述的微反應(yīng)器，由蓋板和反應(yīng)板組成，反應(yīng)板中心的凹槽中含有可拆換 的微通道芯片，微通道芯片上緊密蜿蜒刻有通道，通道的上表面敞開，通道的下表面和側(cè) 面封閉，通道總長為50-200mm，通道的切面呈上寬下窄的類梯形結(jié)構(gòu)，類梯形的長邊為 0. 5-1. 5mm，類梯形的短邊為0. 1~0. 4mm，類梯形的高為0. 3-1. 0mm，類梯形的四個角按照 圓角化處理，圓角化直徑為0. 1mm ;所述反應(yīng)器的蓋板與反應(yīng)板之間設(shè)有固定夾以防止溶 液側(cè)漏，其中，蓋板的材質(zhì)為玻璃或不銹鋼，反應(yīng)板材質(zhì)為不銹鋼。
[0013] 其中，所述的微反應(yīng)器預(yù)先經(jīng)過如下處理：將聚二甲基硅氧烷溶膠涂抹在蓋板內(nèi) 側(cè)，再用篩板將SH-Ti0 2粉末均勻分布在聚二甲基硅氧烷溶膠上，放入60-80°C烘箱中烘烤 100-200min，使溶膠凝固。
[0014] 其中，所述的SH-Ti02按照如下方法等比例放大或縮小制備得到：將lgTi02分散 于30-50ml的甲苯中，加入5~10ml 3-巰丙基三甲氧基硅烷，在110°C油浴回流6-10h，將 樣品抽濾，甲苯洗滌；將濾出樣品置于索氏抽提器中，用乙醇于回流溫度下抽提12-24h，以 除去未反應(yīng)的偶聯(lián)劑；抽濾后取出樣品在60°C下干燥24-48h后即可得到SH-Ti0 2。優(yōu)選的 是，將lgTi02分散于50ml的甲苯中，加入5ml 3-巰丙基三甲氧基硅烷，在110°C油浴回流 8h，將樣品抽濾，甲苯洗滌；將濾出樣品置于索氏抽提器中，用乙醇于回流溫度下抽提24h， 以除去未反應(yīng)的偶聯(lián)劑；抽濾后取出樣品在60°C下干燥24h后即可得到SH-Ti0 2。
[0015] 其中，所述的篩板孔徑800目。
[0016] 其中，將菊粉內(nèi)切酶固定在微反應(yīng)器內(nèi)的方法如下：將菊粉內(nèi)切酶液注入可拆換 的微通道芯片（3)中，流速控制在1-100 yL/min，保留時間為1-5小時，用超純水沖洗多余 的酶液，實(shí)現(xiàn)酶的固定化。
[0017] 其中，所述的菊粉內(nèi)切酶，比酶活200-300U/mg，微反應(yīng)器的固載量為50-200mg。 酶活分析方法如下：1 mL酶液加入4mL3%的菊粉液（用0. lmol/L，pH4. 5醋酸緩沖液配 制），50 °C下反應(yīng)30min，沸水浴煮沸5min，后取0. 5ml反應(yīng)液，加入1. 5mL水和1. 5mL3, 5 一二硝基水楊酸試劑，沸水浴加熱5min，立即冷卻定容至25ml，540nm下測定吸光度，對照 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)生成的還原糖量；在相同條件下，以每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 ymol還原糖 所需的酶量為一個酶活力單位。
[0018] 其中，微反應(yīng)器中菊粉內(nèi)切酶的酶活為4. 2KU，固載量為20mg，將底物菊粉水溶液 注入到微反應(yīng)器中，底物流速為0. 1-lmL/min，反應(yīng)溫度為55-65°C，底物pH在3. 5-5. 5,反 應(yīng)料液在微反應(yīng)器中循環(huán)連續(xù)流動的保留時間為2h，再調(diào)整反應(yīng)流速在0. lmL/min，調(diào)整 反應(yīng)溫度為65°C、調(diào)整底物pH為3. 5,反應(yīng)料液在微反應(yīng)器中循環(huán)連續(xù)流動的保留時間為 4h，制備得到的低聚果糖中，蔗果四糖的濃度在60wt %以上。
[0019] 有益效果：本發(fā)明選擇利用微反應(yīng)器酶解菊粉生成低聚果糖，反應(yīng)效率大大提高， 耗能減少；同時，通過變操作條件控制，可顯著提高產(chǎn)物中蔗果四糖的含量，強(qiáng)化低聚果糖 在預(yù)防和治療心血管疾病上的作用。本發(fā)明的裝置可以拆換微反芯片，結(jié)構(gòu)簡單，并且只需 簡單的將數(shù)目放大即可等比例的擴(kuò)大生產(chǎn)能力，具有良好的工業(yè)化前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明微反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021] 圖2可拆換反應(yīng)芯片放大圖。
[0022] 圖3為圖2畫圈處通道切面結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 由圖1所示，本發(fā)明的微反應(yīng)器，由蓋板1和反應(yīng)板2組成，反應(yīng)板中心的凹槽中 含有可拆換的微通道芯片3,由圖2可知微通道芯片3上緊密蜿蜒刻有通道，通道的上表面 敞開，通道的下表面和側(cè)面封閉，通道總長為50-200mm，通道的切面呈上寬下窄的類梯形結(jié) 構(gòu)（圖3)，類梯形的長邊為0? 5-1. 5mm，短邊為0? 1~0? 4mm，高為0? 3-1. 0mm，類梯形的四 個角按照圓角化處理，圓角化直徑為〇. 1_ ;所述反應(yīng)器的蓋板1與反應(yīng)板2之間設(shè)有固定 夾以防止溶液側(cè)漏，其中，蓋板的材質(zhì)為玻璃或不銹鋼，反應(yīng)板材質(zhì)為不銹鋼。
[0026] 實(shí)施例2 :