一種三磷酸腺苷(atp)的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用腺苷(AR)為原料生產(chǎn)三磷酸腺苷(ATP)的方法，具體涉及三磷酸腺苷發(fā)酵合成二步發(fā)酵:第一步為發(fā)酵提轉(zhuǎn)化酶，第二步為在轉(zhuǎn)化酶的催化作用下將腺苷磷酸化為三磷酸腺苷。
【背景技術(shù)】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是一種由一個(gè)腺嘌呤，一個(gè)核糖和一個(gè)三磷酸單位組成的核苷酸藥物，分子式CltlH16N5O13P3，分子量為507。它是生物體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器和貯存器，在人體能量代謝中起著重要的作用。ATP也是生物體內(nèi)重要的代謝物質(zhì)，作為代謝的中間體、輔酶參與生物體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖類和核酸等的代謝。在臨床應(yīng)用上，ATP除了能作為搶救危重病人的輔助藥品外，還對急慢性肝炎、腎炎、心肌炎、冠狀動(dòng)脈硬化、進(jìn)行性肌肉萎縮、再生障礙性貧血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥具有良好的治療作用。三磷酸腺苷二鈉原料以及注射液已收載于《中國藥典》2010年版二部。
[0003]三磷酸腺苷的合成主要有化學(xué)合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。考慮到藥品的安全性、環(huán)保、生產(chǎn)成本等因素，用腺苷為原料微生物酶系催化合成三磷酸腺苷成為目前工業(yè)生產(chǎn)三磷酸腺苷的主要工藝。然而，我國三磷酸腺苷生產(chǎn)水平總體還比較低，產(chǎn)品的產(chǎn)量、回收率、產(chǎn)品的純度等方面達(dá)不到進(jìn)口產(chǎn)品的水平。
申請?zhí)枮?5100148.5的中國專利申請文件中公開了一種“用腺苷(AR)為原料生產(chǎn)腺苷三磷酸(ATP)的新工藝”。該工藝主要包括:啤酒酵母冷凍處理、發(fā)酵提酶、離心分離、腺苷發(fā)酵合成ATP、酒精沉淀、沉淀物回溶、冷凍除鹽、稀釋后離子交換、樹脂洗滌洗脫、樹脂脫色、活性炭除熱源、結(jié)晶、干燥等。該工藝由于酵母與轉(zhuǎn)化酶的分離不徹底，發(fā)酵后期酵母所產(chǎn)酶系成分變化，轉(zhuǎn)化酶活力下降，使得三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化率為90%，而且發(fā)酵過程中因菌體衰老自溶等因素帶入較多雜物等問題；其次在發(fā)酵合成液中除了有三磷酸腺苷外，還有未反應(yīng)的AR及副反應(yīng)產(chǎn)物AMP、ADP，及微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等無機(jī)鹽。發(fā)酵合成液中無機(jī)鹽的濃度約4萬mg/L。在離子交換吸附過程中，離子與ATP競爭吸附到離子交換樹脂上，造成樹脂吸附ATP量僅約5?13克/100克樹脂(201 X 7)，采用酒精沉淀脫鹽工藝后樹脂吸附ATP量提高到18?22克/100克樹脂(201 X 7)，但需要消耗ATP發(fā)酵液體積4?5倍的無水乙醇。三磷酸腺苷回收率和設(shè)備利用率低，產(chǎn)品中雜質(zhì)較多。
[0004]綜合以上【背景技術(shù)】，如何通過高效分離技術(shù)提高酶液的純度和降低合成液中無機(jī)鹽的含量，從而提高三磷酸腺苷的產(chǎn)量、回收率、純度成為亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種能提高ATP產(chǎn)品的生產(chǎn)能力、回收率、產(chǎn)品純度，降低化學(xué)試劑的消耗，簡化生產(chǎn)工藝，減少污染排放，明顯提高經(jīng)濟(jì)效益的三磷酸腺苷的生產(chǎn)方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，一種三磷酸腺苷(ATP)的生產(chǎn)方法，它主要是利用酵母細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)，以葡萄糖為能源經(jīng)糖酵解途徑使腺苷(AR)磷酸化合成三磷酸腺苷，所述的生產(chǎn)方法包括如下步驟:
a)發(fā)酵反應(yīng)鍋中加去離子水，將水的溫度升到30?42°C，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀溶液，調(diào)節(jié)PH值在6.0?7.0范圍內(nèi)，保持溫度為30?42°C并發(fā)酵2.0?2.5小時(shí)提轉(zhuǎn)化酶，得到發(fā)酵提酶液；上述各反應(yīng)物的用量為:啤酒酵母泥250?280g/L，葡萄糖35?45 g/L，磷酸氫二鉀25?30 g/L，磷酸二氫鉀 20 ?25 g/L ο
[0007]b)發(fā)酵提酶液需經(jīng)過板框過濾去除酶液中顆粒度較大的酵母泥雜質(zhì)，得到粗濾提酶液；
c)經(jīng)過板框過濾的粗濾提酶液再經(jīng)過精度為0.1?10 μm的微濾膜處理，進(jìn)一步去除細(xì)微的酵母等雜質(zhì)，得到清酶液；
d)在清酶液中加入反應(yīng)物腺苷20?40g/L，再加入營養(yǎng)物質(zhì)硫酸鎂1.6?2.0g/L，調(diào)節(jié)PH值在6.0?7.0范圍內(nèi)，并在溫度為32?35°C條件下發(fā)酵4.0?6.0小時(shí)，腺苷由葡萄糖提供能量，在轉(zhuǎn)化酶的催化作用下，腺苷磷酸化為三磷酸腺苷，三磷酸腺的濃度為36?72g/L ;立即加冰水冷卻，將溫度降低到15?20°C ；
e)采用截留分子量為150?500的納濾膜，通過納濾膜的選擇透過性能使單價(jià)的離子透過膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的無機(jī)鹽被去除，三磷酸腺苷因分子較大被納濾膜截留在濃縮液中，得到三磷酸腺苷濃縮液；
f)經(jīng)過去除無機(jī)鹽的三磷酸腺苷合濃縮液用去離子水稀釋，使三磷酸腺苷的濃度調(diào)整到 0.5 ?1.5% ；
g)上述稀釋后的三磷酸腺苷溶液通過201X 7陰離子交換樹脂吸附，樹脂粒度0.315?
1.25mm ;吸附結(jié)束后用去離子水和0.04?0.06%氯化鈉溶液洗滌，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副產(chǎn)物，再用4.0?6.0%的氯化鈉溶液洗脫，得到三磷酸腺苷洗脫液；
h)三磷酸腺苷洗脫液經(jīng)過截留分子量為3000?10000的超濾膜處理去除蛋白質(zhì)和熱源，通過活性炭吸附去除色度物質(zhì)；
i)上述經(jīng)過超濾膜處理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脫液經(jīng)過無水乙醇沉淀、離心分離、淋洗和浸泡提純，得到三磷酸腺苷固體，無水乙醇的用量為三磷酸腺苷超濾膜透過液的
2.5?3.5倍，再經(jīng)過38?42°C的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。
[0008]本發(fā)明優(yōu)選的是:所述的步驟a)中所加入的啤酒酵母，需先經(jīng)過-15?-20°C冷凍處理，冷凍處理7?10天；
步驟c)中，微濾膜的形式有平板式、中空纖維式等，膜材料選用PP、N-6、PS、PES,PVDF中的一種，操作壓力小于1.0MPa，溫度5?40°C ；
步驟e)中，選用納濾膜的形式包括平板式、中空纖維式，膜材料有芳香族聚酰胺復(fù)合膜、磺化聚醚砜，操作壓力0.8?2.5MPa，溫度5?40°C，濃縮3?10倍；
步驟g)中，納濾脫鹽工藝除鹽后，201 X 7陰樹脂的吸附ATP量由原來的5?13g/100g樹脂，提高到24?28g/100g樹脂，優(yōu)于乙醇沉淀脫鹽工藝吸附18?22 g/100g樹脂的水平，并且無乙醇的使用；陰離子交換樹脂選用凝膠或大孔強(qiáng)堿性的陰樹脂； 步驟h)中，超濾工藝的超濾膜為卷式膜或中空纖維膜，操作壓力0.2?1.5MPa，溫度5?40°C，濃縮3?12倍，膜材料為PP、PAN、PS、PES、PVDF中的任意一種；活性炭為果殼型粉末活性炭或粒狀活性炭。
[0009]本發(fā)明采用微濾處理提高轉(zhuǎn)化酶的純度，提高了三磷酸腺苷的合成轉(zhuǎn)化率；在三磷酸腺苷發(fā)酵合成液的分離提純過程中采用納濾工藝將合成過程中添加的無機(jī)鹽類營養(yǎng)物質(zhì)去除，增強(qiáng)了離子交換樹脂吸附ATP的容量；采用超濾去除蛋白和熱源，提高產(chǎn)品的純度。
[0010]本發(fā)明能使磷酸腺苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上，總回收率由達(dá)到80%以上，純度提高到98%以上。
[0011]本發(fā)明具有能提高ATP產(chǎn)品的生產(chǎn)能力、回收率、產(chǎn)品純度，降低化學(xué)試劑的消耗，簡化生產(chǎn)工藝，減少污染排放，明顯提高經(jīng)濟(jì)效益等特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的介紹:一種三磷酸腺苷(ATP)的生產(chǎn)方法，它主要是利用酵母細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)，以葡萄糖為能源經(jīng)糖酵解途徑使腺苷(AR)磷酸化合成三磷酸腺苷，所述的生產(chǎn)方法包括如下步驟:
a)發(fā)酵反應(yīng)鍋中加去離子水，將水的溫度升到30?42°C，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀溶液，調(diào)節(jié)PH值在6.0?7.0范圍內(nèi)，保持溫度為30?42°C并發(fā)酵2.0?2.5小時(shí)提轉(zhuǎn)化酶，得到發(fā)酵提酶液；上述各反應(yīng)物的用量為:啤酒酵母泥250?280g/L，葡萄糖35?45 g/L，磷酸氫二鉀25?30 g/L，磷酸二氫鉀 20 ?25 g/L ο
[0013]b)發(fā)酵提酶液需經(jīng)過板框過濾去除酶液中顆粒度較大的酵母泥雜質(zhì)，得到粗濾提酶液；
c)經(jīng)過板框過濾的粗濾提酶液再經(jīng)過精度為0.1?10 μm的微濾膜處理，進(jìn)一步去除細(xì)微的酵母等雜質(zhì)，得到清酶液；
d)在清酶液中加入反應(yīng)物腺苷20?40g/L，再加入營養(yǎng)物質(zhì)硫酸鎂1.6?2.0g/L，調(diào)節(jié)PH值在6.0?7.0范圍內(nèi)，并在溫度為32?35°C條件下發(fā)酵4.0?6.0小時(shí)，腺苷由葡萄糖提供能量，在轉(zhuǎn)化酶的催化作用下，腺苷磷酸化為三磷酸腺苷，三磷酸腺的濃度為36?72g/L ;立即加冰水冷卻，將溫度降低到15?20°C ；
e)采用截留分子量為150?500的納濾膜，通過納濾膜的選擇透過性能使單價(jià)的離子透過膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的無機(jī)鹽被去除，三磷酸腺苷因分子較大被納濾膜截留在濃縮液中，得到三磷酸腺苷濃縮液；
f)經(jīng)過去除無機(jī)鹽的三磷酸腺苷合濃縮液用去離子水稀釋，使三磷酸腺苷的濃度調(diào)整到 0.5 ?1.5% ；
g)上述稀釋后的三磷酸腺苷溶液通過201X 7陰離子交換樹脂吸附，樹脂粒度0.315?
1.25mm ;吸附結(jié)束后用去離子水和0.04?0.06%氯化鈉溶液洗滌，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副產(chǎn)物，再用4.0?6.0%的氯化鈉溶液洗脫，得到三磷酸腺苷洗脫液；
h)三磷酸腺苷洗脫液經(jīng)過截留分子量為5000?10000的超濾膜處理去除蛋白質(zhì)和熱源，通過活性炭吸附去除色度物質(zhì)； i)上述經(jīng)過超濾膜處理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脫液經(jīng)過無水乙醇沉淀、離心分離、淋洗和浸泡提純，得到三磷酸腺苷固體，無水乙醇的用量為三磷酸腺苷超濾膜透過液的
2.5?3.5倍，再經(jīng)過38?42°C的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。
[0014]本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例是:所述的步驟a)中所加入的啤酒酵母，需先經(jīng)過-15?_20°C冷凍處理，冷凍處理7?10天；
步驟c)中，微濾膜的形式有平板式、中空纖維式等，膜材料選用PP、N-6、PS、PES,PVDF中的一種，操作壓力小于1.0MPa，溫度5?40°C ；
步驟e)中，選用納濾膜的形式包括平板式、中空纖維式，膜材料有芳香族聚酰胺復(fù)合膜、磺化聚醚砜，操作壓力0.8?2.5MPa，溫度5?40°C，濃縮3?10