一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的物質(zhì)，主要成分為多肽、蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì)復(fù)合物，最早由Jacob于1953年提出。近年來(lái)，廣譜抗生素的普及甚至濫用所帶來(lái)的負(fù)面 效應(yīng)日益突出，新型抗生素替代品的研宄迫在眉睫。作為蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的細(xì)菌素，由于可被 蛋白酶降解，其安全性很高，故受到越來(lái)越多的關(guān)注。盡管目前開(kāi)發(fā)獲得的細(xì)菌素（Nisin) 已具備了極高的防腐與抑菌的應(yīng)用價(jià)值，但受Nisin本身的特性（低pH條件下性質(zhì)穩(wěn)定， pH>7. 0抑菌活性逐漸喪失）的影響，其應(yīng)用的范圍受到了極大的局限性，其次，目前細(xì)菌素 的獲得都來(lái)自化學(xué)合成培養(yǎng)基，此類(lèi)培養(yǎng)基成分多樣，配方復(fù)雜，配制過(guò)程繁瑣具有潛在食 品安全風(fēng)險(xiǎn)，再者，制備細(xì)菌素的成本非常高、細(xì)菌素的來(lái)源相對(duì)有限，上述問(wèn)題很大程度 上限制了細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)和利用。
[0003] 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（CN 103740618A)公開(kāi)了類(lèi)芽孢桿菌屬的一個(gè)新菌種， Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并將其中的模式菌株 BD3526 于 2013 年 10 月 14 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號(hào)為： CGMCC No. 8333,該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產(chǎn)胞外多糖的生理特性，但尚 未得到該菌株產(chǎn)出的抑菌性細(xì)菌素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有細(xì)菌素穩(wěn)定性差，制備成本高，來(lái)源 不足的現(xiàn)狀，提供了一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp. )CGMCC No. 8333菌株發(fā)酵番茄汁 培養(yǎng)基獲得的發(fā)酵液上清經(jīng)超濾截取的低分子量部分，經(jīng)冷凍干燥后可獲得具有強(qiáng)烈抑菌 性的類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物，通過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，該細(xì)菌素提取物的抑菌效果穩(wěn)定，從而完成 了本發(fā)明。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提 取物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0007] (1)將類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)接種于番茄汁培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)獲得發(fā) 酵液；
[0008] (2)將步驟（1)所得發(fā)酵液離心取上清，超濾取低分子部分，冷凍干燥即得。
[0009] 其中步驟（1)為將類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)接種于番前汁培養(yǎng)基中震蕩 培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。其中所述類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)為本領(lǐng)域常規(guī)的類(lèi)芽孢桿 菌，較佳地為類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 8333。所述類(lèi)芽 孢桿菌為現(xiàn)有技術(shù)，其制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò)從保藏中心購(gòu)買(mǎi)獲得。其 中所述番茄汁培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的番茄汁培養(yǎng)基，所述的番茄汁培養(yǎng)基較佳地由包括由 以下步驟組成的方法制備而得：清洗成熟番茄，去皮，榨汁，過(guò)濾后煮沸，4, 000-12, OOOg離 心5~lOmin，取上清，滅菌，冷卻即得。其中所述的過(guò)濾采用的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的過(guò)濾 方法，較佳地為采用100目紗布過(guò)濾，煮沸的時(shí)間較佳地為1~10分鐘，所述番茄汁培養(yǎng)基 的pH值較佳地為pH6. 0~8. 0,所述的滅菌溫度較佳地為110~135°C，滅菌時(shí)間較佳地為 10~30分鐘。其中所述類(lèi)芽孢桿菌的接種量較佳地為1~5%，更佳地為2~3%，最優(yōu)選 2. 5%，所述百分比為體積百分比，類(lèi)芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)的溫度較佳地為25°C~37°C，更 佳地為30°C~35°C，最優(yōu)選為32°C，所述震蕩的速度較佳地為lOOrpm~300rpm，更佳地為 150rpm~250rpm，最優(yōu)選地為200rpm，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間較佳地為24小時(shí)~72小時(shí)，更 佳地為36小時(shí)~48小時(shí)，最優(yōu)選地為42小時(shí)。當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度和時(shí)間，或者類(lèi)芽 孢桿菌的接種量不在上述范圍值之內(nèi)時(shí)，所得發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果會(huì)產(chǎn)生顯著降低。
[0010] 發(fā)明所述制備方法中，將所述類(lèi)芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種于番茄汁培養(yǎng)基之 前，較佳地還包括該類(lèi)芽孢桿菌CGMCC No. 8333活化獲得類(lèi)芽孢桿菌種子的步驟。所述活 化的步驟較佳地為：將本發(fā)明所述類(lèi)芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種在TYC固體培養(yǎng)基中， 25~30°C培養(yǎng)18~28小時(shí)即得類(lèi)芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子；將所得類(lèi)芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子的菌落均勻分散于TYC液體培養(yǎng)基內(nèi)，再按2%~5%體積百分比的接種量接 種于TYC液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100~200rpm，培養(yǎng)18-28小時(shí)，將所得培養(yǎng) 物離心棄去上清，所得菌體用無(wú)菌蒸餾水洗滌后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，即得發(fā) 酵用的類(lèi)芽孢桿菌的種子。
[0011] 其中所述步驟⑵為將步驟（1)所得發(fā)酵液離心取上清，超濾取低分子部分，冷凍 干燥即得。
[0012] 其中所述離心的速度較佳地為8, 000~12, 000g，更佳地為10000~11000g，離心 的時(shí)間較佳地為5~10分鐘，更佳地為6~8分鐘。當(dāng)所述離心的速度和離心的時(shí)間不在 上述范圍值之內(nèi)時(shí)，所得發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果會(huì)產(chǎn)生顯著降低，其抑菌性能的穩(wěn)定性也會(huì) 大幅下降。
[0013] 其中所述的超濾為本領(lǐng)域常規(guī)的超濾方法，所述超濾是指以大分子與小分子分離 為目的，以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定 孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部 分的純化。
[0014] 所述超濾中使用的超濾膜為本領(lǐng)域常規(guī)的超濾膜，所述超濾膜的截留分子量較佳 地為3, 000~8, 000Da，更佳地為5, 000Da。
[0015] 其中所述的冷凍干燥為本領(lǐng)域常規(guī)的冷凍干燥方法，所述冷凍干燥方法較佳地 為真空冷凍干燥，所述真空冷凍干燥條件較佳地為：板層極限溫度< -60°C，冷阱極限溫 度_70°C，板層裝料厚度0. 5~2. 0mm，真空度10~30Pa。
[0016] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二為：一種如本發(fā)明所述的制備 方法所得類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物。
[0017] 本發(fā)明所述類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物的制備方法中各步驟所述技術(shù)特征的優(yōu)選 范圍與上文所述類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物的制備方法中相應(yīng)的內(nèi)容完全一致，具體請(qǐng)參見(jiàn) 上文所述內(nèi)容，此處不再贅述。
[0018] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為：如本發(fā)明所述的類(lèi)芽孢桿 菌細(xì)菌素提取物在制備食品防腐劑中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明所述類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物可以廣泛應(yīng)用于制備各種食品防腐劑，功能 性食品或者功能性飼料中。所述應(yīng)用較佳地為在制備食品防腐劑中的應(yīng)用。
[0020] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0021] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0022] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0023] 1、目前細(xì)菌素提取物的制備都依賴(lài)于化學(xué)合成培養(yǎng)基，而運(yùn)用番茄汁制備細(xì)菌素 提取物的研宄尚未報(bào)道過(guò)，本發(fā)明首次將番茄汁培養(yǎng)基作為一種天然的發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)用于 細(xì)菌素提取物的制備，因而其廣物具有更尚的食品安全性。
[0024] 2、本發(fā)明所述用于制備類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物的原料為番茄，其來(lái)源廣、成本 低，發(fā)酵菌種為類(lèi)芽孢桿菌單一菌種，上述組合有利于產(chǎn)品品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化與工業(yè)大規(guī)模生 產(chǎn)的成本控制。
[0025] 3、解決了當(dāng)前細(xì)菌素來(lái)源狹隘的現(xiàn)狀，開(kāi)創(chuàng)性地將類(lèi)芽孢桿菌應(yīng)用于細(xì)菌素的制 備工藝。
[0026] 4、本發(fā)明所述的類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素提取物的制備方法工藝簡(jiǎn)單，僅需四步：發(fā)酵、 離心、超濾、凍干即可完成，大大減少了傳統(tǒng)復(fù)雜工藝可能帶來(lái)的污染問(wèn)題，其次，整個(gè)制備 過(guò)