一種脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種體外細胞凋亡模型的建立方法，尤其涉及一種脂多糖誘導奶牛乳 腺上皮細胞凋亡模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺炎常發(fā)生于奶牛和奶山羊等反芻動物，是由病原菌引起的乳腺的一種炎癥反 應(yīng)，可導致嚴重的經(jīng)濟損失。目前，各國學者都試圖探尋一種典型、廉價、易于建立的乳房炎 動物模型，用以研宄乳房炎的發(fā)病機理和尋求更好的防治藥物。目前，國內(nèi)外已有多篇報 道關(guān)于向奶牛、奶山羊和小鼠等動物乳腺內(nèi)灌注病原菌和內(nèi)毒素等方法制作乳房炎動物模 型，然而由于實驗性奶牛和奶山羊乳房炎模型費用高，使其在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用受到 限制。因此，建立一種符合臨床發(fā)病機制的體外乳腺炎模型對研宄乳腺炎發(fā)病機理和防治 更具有重要價值和實際意義。
[0003] 乳腺是一個復雜的器官，由多種類型不同的細胞組成，這些細胞在乳腺的免疫生 物學方面都發(fā)揮著各不相同的作用。最新研宄結(jié)果表明乳腺上皮細胞在乳腺感染的過程中 可能存在主動的應(yīng)對反應(yīng)，但對其機制還了解甚少，是目前國內(nèi)外研宄的熱點。
[0004] 脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS)，是革蘭氏陰性菌（G-)細胞外膜上一種大分 子結(jié)構(gòu)成分。牛的乳腺對LPS的刺激非常敏感，乳腺內(nèi)灌注LPS，能夠誘導出明顯的乳房炎 癥狀，同時可增加血液和乳汁中脂多糖結(jié)合蛋白和可溶性CD14的水平及炎性因子的釋放， 其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和G-菌感染引起的炎癥反應(yīng)有著極其相似的地方，因此在臨床上有著 極為廣泛的應(yīng)用。且已有研宄報道表明，在體外經(jīng)LPS刺激，乳腺上皮細胞亦能分泌炎癥相 關(guān)的介質(zhì)來介導細胞損傷。
[0005] 故本發(fā)明通過觀察不同質(zhì)量濃度的LPS對奶牛乳腺上皮細胞增殖活性、凋亡比例 以及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)變化的作用，評估LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法，可 為進一步研宄乳腺上皮細胞凋亡信號調(diào)控奠定基礎(chǔ)，為奶牛乳腺炎發(fā)病機理及防治研宄提 供試驗模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法，本發(fā)明所 述脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法能夠準確測定LPS誘導奶牛乳腺上 皮細胞凋亡模型的誘導條件。
[0007] -種脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法，其中，包括如下步驟：
[0008] (1)培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞，獲取2-3代對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)試驗；
[0009](2)取所述2-3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞，以IX 104個/孔的密度接種 于72個96孔板，隨機分為6個試驗組，用CCK-8法檢測所述6個試驗組的細胞抑制率；所 述6個試驗組的設(shè)置條件為：向所述6個試驗組96孔板每孔中分別加入含LPS的培養(yǎng)液 100 y L，6個試驗組加入的所述培養(yǎng)液中LPS質(zhì)量濃度分別為0、10、20、50、100和200 y g/ mL，所述6個試驗組的作用時間段設(shè)置均分別包括3、8、16和24h ;每組/每時間段3個復 板；選取所述LPS質(zhì)量濃度為0 y g/mL的試驗組為對照組，對所述各試驗組各時間段得到的 細胞抑制率進行統(tǒng)計學分析；找出所述細胞抑制率在40%~50%之間的所述試驗組及其 作用時間段。
[0010] 經(jīng)統(tǒng)計分析得出以下結(jié)果：所述細胞抑制率在40%~50%之間的所述試驗組及 其作用時間段為50 y g/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮細胞24h和100 y g/mL LPS作用于奶 牛乳腺上皮細胞8h。
[0011] (3)根據(jù)步驟（2)的結(jié)果，取所述2-3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞，以5X105 個/mL的密度每孔吸取2. 5mL接種于6孔板，隨機分成3個試驗組，每組3個復孔；用流式 細胞術(shù)檢測所述3個試驗組的細胞凋亡率；所述3個試驗組的設(shè)置條件為：向所述3個試 驗組6孔板每孔中分別加入含LPS的培養(yǎng)液2. 5mL，3個試驗組加入的所述培養(yǎng)液中LPS質(zhì) 量濃度和作用時間分別為含〇 U g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液作用24h、含50 y g/mL質(zhì)量濃 度LPS的培養(yǎng)液作用24h、含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液作用8h。選取所述0 y g/mL LPS作用細胞24h的處理組為對照組，并對所述各試驗組細胞凋亡率進行統(tǒng)計學分析。找出 所述細胞凋亡率在40%~50%之間的所述試驗組。
[0012] 經(jīng)統(tǒng)計分析得出以下結(jié)果：所述細胞凋亡率在40%~50%之間的所述試驗組為 100 y g/mLLPS作用于奶牛乳腺上皮細胞8h組。
[0013] (4)根據(jù)步驟（2)的結(jié)果，取所述2-3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞，以5X10 5 個/mL的密度每皿吸取5mL接種于25cm2培養(yǎng)皿中，隨機分成3個試驗組，每組3個復皿， 用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測所述3個試驗組的細胞DNA完整性；所述3個試驗組的設(shè)置條 件為：向所述3個試驗組25cm2培養(yǎng)皿每皿中分別加入含LPS的培養(yǎng)液5mL，3個試驗組加 入的所述培養(yǎng)液中LPS質(zhì)量濃度和作用時間分別為含0 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液作用 24h、含50 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液作用24h、含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液作 用8h。選取所述0 y g/mL LPS作用細胞24h的處理組為對照組，比較分析所述3個試驗組 細胞的DNA Ladder電泳圖，找出具有典型細胞凋亡DNA梯狀帶電泳圖譜的所述試驗組。 [0014] 經(jīng)比較分析得出以下結(jié)果：所述具有典型細胞凋亡DNA梯狀帶電泳圖譜的所述試 驗組為100 y g/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮細胞8h組。
[0015] (5)根據(jù)步驟（3)和⑷的結(jié)果，選擇所述LPS質(zhì)量濃度100 y g/mL為作用濃度， 8h為作用時間，進一步從細胞形態(tài)學上驗證所述奶牛乳腺上皮細胞凋亡時的內(nèi)部超微形態(tài) 變化特征；取所述2-3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞，以5X 105個/mL的密度每孔吸取 2. 5mL接種于6孔板中，隨機分成2個試驗組，每組3個復孔，用透射電鏡觀察術(shù)檢測所述2 個試驗組的細胞內(nèi)部超微形態(tài)學變化；所述2個試驗組的設(shè)置條件為：向所述2個試驗組6 孔板每孔中分別加入含LPS的培養(yǎng)液2. 5mL，2個試驗組加入的所述培養(yǎng)液中LPS質(zhì)量濃度 和作用時間分別為含〇 U g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液作用8h和含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS 的培養(yǎng)液作用8h ;選取所述0 y g/mL LPS作用細胞8h的處理組為對照組，找出所述細胞內(nèi) 部超微形態(tài)出現(xiàn)典型凋亡特征的所述試驗組。
[0016] 經(jīng)比較分析得出以下結(jié)果：所述細胞內(nèi)部超微形態(tài)出現(xiàn)典型凋亡特征的所述試驗 組為100 y g/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮細胞8h組。
[0017] 綜合比較分析步驟（2)、（3)、（4)、（5)的結(jié)果得出如下結(jié)論：確定100 y g/mL LPS 作用于奶牛乳腺上皮細胞8h為建立脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的誘導條件。
[0018] 本發(fā)明所述脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法，其中，所述步驟 (1) 具體包括如下步驟：
[0019] 采用組織塊培養(yǎng)法獲得奶牛乳腺上皮細胞，用含體積分數(shù)10%小牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37°C、C0 2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)純化后取所述 2-3代對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)試驗。
[0020] 本發(fā)明所述脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞凋亡模型的建立方法，其中，所述步驟 (2) 具體包括如下步驟：
[0021] 取所述2~3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞，以1 X 104個/孔的密度接種于72 個96孔板，放入37 °C，C02體積分數(shù)為5 %的培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)24h至細胞80 %融合后，隨機 分成6個試驗組，吸棄上清后，向所述6個