%體積分數(shù)小牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液；所述1^3模型組 加入含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液2mL ;所述第一黃芪多糖模型組加入含100 y g/ mL質(zhì)量濃度LPS、lmg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL;所述第二黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS、3mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL;所述第三黃芪多糖模型 組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、5mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL。
[0046] (3)CCK-8法檢測所述步驟（2)中的①中所述5個試驗組中細胞存活率；
[0047] (4)流式細胞術(shù)檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞周 期；
[0048] (5)瓊脂糖凝膠電泳檢測所述步驟⑵中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞 DNA ladder 條帶；
[0049] (6)透射電鏡觀察所述步驟⑵中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞內(nèi)部超 微結(jié)構(gòu)的變化；
[0050] (7)放射免疫法檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中細胞上清液中炎癥 相關(guān)細胞因子含量；
[0051] (8)生化試劑盒法檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中細胞上清液中炎 癥相關(guān)酶酶活。
[0052] 實施例2
[0053] 一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應(yīng)用方法，包括如下步驟：
[0054] (1)采用組織塊培養(yǎng)法獲得奶牛乳腺上皮細胞，用含10%體積分數(shù)小牛血清的 01^11作12培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于371：、〇) 2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)純化后 取2-3代對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)試驗。
[0055] (2)細胞的分組及處理：
[0056] ①取所述2-3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞制備成1 X 104個/mL的細胞 懸液，按每孔150 yL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C條件下，C02體積分數(shù)為5%的 培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機分為如下5個試驗組：（i )空白對照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii )第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模 型組；（V )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復(fù)；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎(chǔ) 培養(yǎng)液200 111，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含10%體積分數(shù)小牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液；所述1^3 模型組加入含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液200 y L ;所述第一黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS、lmg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液200 y L ;所述第二黃芪多糖 模型組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、3mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液200 y L ;所述 第三黃芪多糖模型組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、5mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液 200 y L ；
[0057] ②取所述2-3代對數(shù)生長期細胞制備成5 X 105-1 X 106個/mL的細胞懸液， 按每孔1. 5mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，在37 °C條件下，C02體積分數(shù)為5 %的培養(yǎng) 箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機分為如下5個試驗驗組：（i )空白對照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii)第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模型 組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復(fù)；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng) 液21^，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含10%體積分數(shù)小牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液；所述1^3模型組 加入含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液2mL ;所述第一黃芪多糖模型組加入含100 y g/ mL質(zhì)量濃度LPS、lmg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL ;所述第二黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS、3mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL ;所述第三黃芪多糖模型 組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、5mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL。
[0058] (3)所述步驟⑵中的①中得到的5個試驗組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，每孔加入10yL 的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1~4h，觀察培養(yǎng)基顏色變化，在全自動酶標(biāo)儀測定各孔在490nm 處的吸光度值，分別計算得到所述5個試驗組細胞抑制率、細胞存活率，所述細胞抑制率的 計算方法為：細胞抑制率=1-(試驗組0D值/對照組0D值）X 100 %，細胞存活率=1-細 胞抑制率；對照組的細胞存活率定義為100%。
[0059] 結(jié)果如圖1所示：與空白對照組相比，LPS模型組細胞存活率極顯著降低 (P〈0. 01);與LPS模型組相比，第一、第二和第三黃芪多糖模型組細胞存活率均極顯著提 高（P〈0. 01);將空白對照組細胞存活率定為100%，統(tǒng)計數(shù)據(jù)后，LPS模型組細胞存活率為 50. 64%，表明LPS模型組細胞還原CCK-8的能力下降，細胞活力下降；第一、第二和第三黃 芪多糖模型組細胞存活率分別為：62. 94%、74. 85%和85. 13%，說明黃芪多糖能顯著抑制 LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細胞凋亡損傷，對乳腺上皮細胞有保護作用。
[0060] (4)所述步驟⑵中的②中得到所述5個試驗組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，分別進行胰 酶消化得到單細胞懸液并分別移至離心管中進行第一次離心，所述第一次離心為在室溫條 件下1500rpm離心5min，小心吸除上清液后，再分別加入lmL PBS吹打細胞沉淀后轉(zhuǎn)移至流 式上樣管中，再次離心并吸除上清，所述再次離心與所述第一次離心條件相同，所述吸除上 清液時留50 y L上清液以免吸走細胞，得到細胞周期待測樣品；將所述細胞周期待測樣品 分別進行流式細胞術(shù)檢測。
[0061] 結(jié)果如表1所示：LPS模型組與對照組比較，h/h期乳腺上皮細胞極顯著增加 (P〈0.01)，S期、G 2/M期細胞數(shù)、增殖指數(shù)（PI)均極顯著降低（P〈0.01)，并出現(xiàn)了凋亡峰； 與LPS模型組相比，第一黃芪多糖模型組各細胞周期內(nèi)細胞比例及增殖指數(shù)均無顯著變 化，也有凋亡峰的出現(xiàn)；與LPS模型組相比，第二黃芪多糖模型組期乳腺上皮細胞極 顯著減少（P〈0.01)，S期細胞比例、增殖指數(shù)均極顯著增加（P〈0.01);與LPS模型組相比， 第三黃芪多糖模型組Gc/Gi期乳腺上皮細胞極顯著減少（P〈0. 01)，G 2/M期細胞比例顯著增 加（P〈0.05)，，S期細胞比例、增殖指數(shù)均極顯著增加（P〈0.01)。細胞周期中，GcA期細胞 數(shù)量百分比減小，S期細胞數(shù)量百分比增加反映了細胞內(nèi)DNA增殖。結(jié)果提示，3-5mg/mL黃 芪多糖處理后使h/h期的細胞數(shù)量百分比減少，S期細胞數(shù)量百分比以及增殖指數(shù)增加， 說明黃芪多糖能促使凋亡的乳腺上皮細胞停留在S期、細胞DNA合成增加，從而能顯著抑制 LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細胞凋亡損傷，對乳腺上皮細胞有保護作用。
[0062]表1黃芪多糖對LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞凋亡周期的影響
【主權(quán)項】
1. 一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應(yīng)用方法，其特征在于，包括如下 步驟： (1) 培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞，獲取2-3代對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)試驗； (2) 細胞的分組及處理： ① 取所述2-3代對數(shù)生長期奶牛乳腺上皮細胞制備成IXIO4個/mL的細