一種用于鑒定菟絲子的引物對(duì)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種用 于鑒定菟絲子的引物對(duì)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》一部記載，菟絲子來源為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australis R. Br.或英絲子C. chinensis Lam的干燥成熟種子。英絲子是臨床常用中藥，具 有滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效，用于陽瘺遺精，尿有余瀝，遺尿尿頻，腰膝 酸軟，目昏耳嗚，腎虛胎漏，胎動(dòng)不安，脾腎虛瀉；外治白癲病。由于近年本品需求量不斷增 加，價(jià)格較高，臨床工作中摻假嚴(yán)重，以植物種子或泥沙混雜為主。隨著菟絲子的需求量不 斷上升，市場(chǎng)上相繼出現(xiàn)了一些非正品和偽品。為確保藥材市場(chǎng)中菟絲子的質(zhì)量及其臨床 療效，需建立更加快速、準(zhǔn)確的方法來鑒定菟絲子與其混偽品。
[0003] 不同研宄學(xué)者分別采用薄層色譜法、紅外光譜法、高效液相色譜法等對(duì)菟絲子 進(jìn)行鑒定（洪慶紅，成則豐，李群力等.FTIR聚類分析法應(yīng)用于菟絲子真?zhèn)蔚蔫b別，光譜 學(xué)與光譜分析，2008, 28 (8): 1803 ;MinYe，Yan Li, Yuning Yan，et al. Determination of flavonoids in Semen Cuscutae by RP-HPLC. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, 28(3) :621.)，但這些方法比較繁瑣，不利于推廣。
[0004] DNA分子標(biāo)記技術(shù)是近二十年來興起并不斷發(fā)展和完善的新檢測(cè)技術(shù)。而就DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物鑒定中的應(yīng)用而言，DNA分子標(biāo)記則是從分子水平上客觀地反映 待測(cè)材料基因片段之間的差異，鑒別結(jié)果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料來源的影響，一般 通過雜交或電泳等方式就能直觀地體現(xiàn)出來，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
[0005] 綜上所述，不同研宄學(xué)者分別采用薄層色譜法、紅外光譜法、高效液相色譜法等方 法對(duì)菟絲子藥材進(jìn)行鑒定研宄，但這些方法測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)，因此相比較熒光染色方法繁瑣， 不利于現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別的應(yīng)用與推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定菟絲子的引物對(duì)。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定菟絲子的引物對(duì)，具體為由序列表中序列1 和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0008] 所述引物對(duì)中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨(dú)包裝，也可以按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定菟絲子的試劑盒。
[0010] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定菟絲子的試劑盒，具體可含有所述引物對(duì)、 dNTP和DNA聚合酶。
[0011] 根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有熒光染料SYBR Green I。
[0012] 制備所述引物對(duì)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 制備所述引物對(duì)的方法，具體可包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別 單獨(dú)包裝的步驟。
[0014] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0016] A)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)：
[0017] B)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
[0018] 所述引物對(duì)，或所述試劑盒，在鑒定或輔助鑒定菟絲子中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0019] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)樣品中是否含有菟絲子的方法。
[0020] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品中是否 含有菟絲子的方法，具體可包括如下步驟：
[0021] (a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0022] (b)為如下（bl)或（b2):
[0023] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測(cè)樣品中是否含有 菟絲子：若PCR產(chǎn)物中含有250-500bp (如460-480bp)的DNA片段，則所述待測(cè)樣品中含有 或候選含有菟絲子；若PCR產(chǎn)物中不含有250-500bp (如460-480bp)的DNA片段，則所述待 測(cè)樣品中不含有或候選不含有菟絲子；
[0024] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I，按照如下方法 確定待測(cè)樣品中是否含有菟絲子：若觀察到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品 中含有或候選含有菟絲子；若觀察不到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品不含 有或候選不含有菟絲子。
[0025] 在所述方法的步驟（b2)中，向所述反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I時(shí)， 所述熒光染料SYBR Green I的加入量為：每20 y L所述反應(yīng)體系中加入1 y L 100 X SYBR Green I (Invitrogen公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為1135054)。
[0026] 在所述方法的步驟（b2)中，確定所述反應(yīng)體系是否產(chǎn)生綠色熒光具體是在365nm 紫外波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)的。
[0027] 在所述方法中，所述菟絲子為中藥材。當(dāng)然所述方法也可以用于檢測(cè)菟絲子的基 原植物--南方英絲子（Cuscuta australisR.Br.)或英絲子（C. chinensis Lam)。相應(yīng) 的，所述待測(cè)樣品既可為單一或混合的中藥材成品，也可以為植株。
[0028] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)樣品為菟絲子，還是萊菔子、紫蘇子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子 中的任一種的方法。
[0029] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒，鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品為菟絲 子，還是萊菔子、紫蘇子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子中的任一種的方 法，包括如下步驟：
[0030] (a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0031] (b)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)樣品為菟絲 子，還是萊菔子、紫蘇子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子中的任一種：若 PCR產(chǎn)物中含有250-500bp的DNA片段，則所述待測(cè)樣品為或候選為菟絲子；若PCR產(chǎn)物中 不含有250-500bp的DNA片段，則所述待測(cè)樣品為或候選為萊菔子、紫蘇子、白芥子、青葙 子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子中的任一種；
[0032] 所述待測(cè)樣品為菟絲子、萊菔子、紫蘇子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子 和油菜子中的任一種（既可為中藥材也可為基原植物）。
[0033] 在上述兩方法的步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度可為68°C。
[0034] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)條件如下：94°C lmin; 90°C 15s、68°C 15s