GFRα3的人抗體及其使用方法
【專利說(shuō)明】GFRa3的人抗體及其使用方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及與人膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF)家族受體a3(GFRa3) 特異性地結(jié)合的人源抗體和人源抗體的抗原結(jié)合片段，以及使用這些抗體的治療方法。
[0002] 相關(guān)領(lǐng)域的聲明
[0003] 膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)家族由膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)組成。GDNF家族的各個(gè) 成員均與錨定于與質(zhì)膜結(jié)合的受體的糖基磷脂酰肌醇（GPI)結(jié)合。這一家族的受體被稱 為⑶NF家族受體a(GFRa)。這一受體家族由四個(gè)不同的GFRa受體組成，GFRal-4。 ⑶NF優(yōu)先與GFRa1結(jié)合、NRTN優(yōu)先與GFRa2結(jié)合、ARTN優(yōu)先與GFRa3結(jié)合和PSPN優(yōu) 先與GFRa4結(jié)合。各GDNF家族配體均通過(guò)RET( "在轉(zhuǎn)染期間被重排的"）受體酪氨酸激 酶?jìng)鬟f信號(hào)，RET受體酪氨酸激酶是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的原癌基因。僅當(dāng)所述配體先與其GFRa受 體結(jié)合的條件下RET才能夠被⑶NF家族成員活化（Airaksinen，M.S.等，NatureReviews Neuroscience(2002)，3:383-394) 〇
[0004]ARTN和GFRa3均在發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)并且其參與交感神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。在成人 中，GFRa3的表達(dá)主要局限于背根神經(jīng)節(jié)（DRG)的感受神經(jīng)元（Orozco,O.E.等，European J.Neuroscience, (2001)，13:2177-2182)。在成年小鼠中，artemin在睪丸、子宮、甲狀腺、 前列腺和附睪以及在嗅球和腸道和腸系膜的小動(dòng)脈中表達(dá)（Airaksinen，M.S.等，Nature ReviewsNeuroscience(2002), 3:383-394 ；Airaksinen,M.S.等，Brain,Behaviorand Evolution, (2006) ,68:181-190)。
[0005] 已在若干研宄中顯示了GFRa3和artemin在痛覺(jué)過(guò)敏中可能的作用。例如，已 證實(shí)將artemin蛋白注射進(jìn)入嗤齒動(dòng)物的后爪會(huì)引起熱痛覺(jué)過(guò)敏，當(dāng)artemin與NGF共同 注射時(shí)這一傷害感受增強(qiáng)（Malin，S.A?等，J.Neuroscience, (2006) ,26 (33): 8588-8599)。 其他研宄顯示在小鼠炎癥模型中arteminmRNA的表達(dá)上調(diào)（Elitt，C.M.等，J.Neuro science, (2006)，26(33) :8578-8587)。而且，其他研宄顯示artemin轉(zhuǎn)基因小鼠TRPV1 和TRPA1的表達(dá)增加并且其對(duì)冷和熱的行為敏感性增加（Elitt，C.M.等，J.Neuroscien ce, (2006)，26 (33) : 8578-8587)。此外，已通過(guò)在GFRa3敲除小鼠中的研宄顯示了GFRa3 在內(nèi)臟高敏感性中可能的作用，在使用TNBS(2, 4, 6-三硝基苯磺酸）灌腸處理后與野生 型C57BL/6小鼠相比這些小鼠顯示出內(nèi)臟高敏感性的降低（Tanaka,T.等，Am.J.Physiol. Gastrointest.LiverPhysiol. (2011)，300:G418-G424)。還通過(guò)一項(xiàng)在接受了膜頭切除的 患者中進(jìn)行的研宄顯示了artemin及其受體GFRa3在與胰腺炎相關(guān)的疼痛中可能的作用 (Ceyhan，G. 0?等，Gut, (2007)，56:534-544)。基于上述情況，獲準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步的研宄，以確 定使用GFRa3活性抑制劑的治療是否對(duì)患有疼痛/痛覺(jué)過(guò)敏和/或高敏感性的患者可能 是有益的。
[0006] 在US6, 861，509中描述了結(jié)合GFRa3的抗體。此外，US6, 677, 135中披露了全長(zhǎng) 的GFRa3 序列，而在US7,026, 138、US2007/0232535 和US2006/0216289 中描述了GFRa3 分子的剪接變體。US7, 138, 251中披露了與全長(zhǎng)的GFRa3具有99%-致性的序列并且在 這篇專利中描述了針對(duì)這一分子的人源化單克隆抗體的制備。
[0007] 發(fā)明簡(jiǎn)沐
[0008] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了全人源單克隆抗體（mAb)及其抗原結(jié)合片段，所述 全人源單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段與人GFRa3結(jié)合并抑制或阻斷其活性，例如阻斷 GFRa3與膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子artemin的結(jié)合，并且可能阻斷RET受體酪氨酸 激酶隨后的活化和/或阻斷通過(guò)RET介導(dǎo)的信號(hào)和/或阻斷通過(guò)RET以外的其他介質(zhì)介導(dǎo) 的信號(hào)。所述抗體或其抗原結(jié)合片段可以用于治療針對(duì)任意感官刺激導(dǎo)致的痛覺(jué)過(guò)敏、異 常疼痛和/或高敏感性，包括但不限于壓力、熱和/或冷。所述抗體還可以用于治療與廣泛 的狀況和病癥相關(guān)的疼痛/高敏感性，在所述狀況和病癥中需要阻斷GFRa3與artemin的 相互作用。所述抗體還可以用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和/或轉(zhuǎn)移。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體 或其抗原結(jié)合片段特異性地與人GFRa3結(jié)合并且具有一個(gè)或多個(gè)下述特征：
[0010] ⑴通過(guò)表面等離子體共振測(cè)定顯示出的Kd范圍為約10,至約1(T13M;
[0011] (ii)顯示出將GFRa3與其配體artemin的結(jié)合阻斷約50-100%的能力，其IC5Q 值范圍為約40pM至約15nM;
[0012] (iii)顯示出將GFRa3與使用artemin和RET的混合物涂覆的固體支持物的結(jié)合 阻斷約20 %至約100%的能力；
[0013] (iv)阻斷或抑制artemin依賴性RET的活化，其IC5Q范圍為約200pM至約50nM ;
[0014] (v)在骨癌疼痛體內(nèi)模型中抑制或減輕一種或多種疼痛感受性反應(yīng)；
[0015] (vi)在體內(nèi)抑制或減輕artemin敏感性熱痛覺(jué)過(guò)敏；
[0016] (vii)在骨關(guān)節(jié)炎體內(nèi)模型中抑制或減輕觸誘發(fā)痛；
[0017] (viii)不與RET的其他GFR共受體發(fā)生交叉反應(yīng)；
[0018] (ix)包含重鏈可變區(qū)（HCVR)，所述重鏈可變區(qū)具有選自下組的氨基酸序列：SEQ IDN0 :2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、 306、322、338、354、381和 397;或
[0019] (x)包含輕鏈可變區(qū)（LCVR)，所述輕鏈可變區(qū)具有選自下組的氨基酸序列：SEQID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、 330、346、362、389 和 405。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段選自下組：鼠源性 抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人源抗體。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段不與人GFRa 1或 人GFRa 2發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含（a)重鏈可變 區(qū)（HCVR)，所述重鏈可變區(qū)具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:2、18、34、50、66、82、 98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381 和 397 以及（b)輕鏈可變區(qū)（LCVR)，所述輕鏈可變區(qū)具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:10、 26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、 346、362、389 和 405。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段顯示出將人GFRa3 與其配體3竹6!^11的結(jié)合阻斷約50-95%的能力，其1(：5(|值范圍為約4(^11至約75(^1。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段將人GFRa3與其 配體artemin的結(jié)合阻斷約75-100%，其IC5(I值范圍為約400pM至約15nM。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷或抑制 artemin依賴性人RET的活化，其IC5(I范圍為約300pM至約5nM。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷或抑制 artemin依賴性獼猴RET的活化，其IC5(I范圍為約0. 7nM至約2. 5nM。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含三個(gè)重鏈 CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重鏈CDR包含在選自下組的HCVR氨基酸序列中：SEQID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、 322、338、354、381 和 397 ;和三個(gè)輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2 和LCDR3)，所述輕鏈CDR包含在 選自下組的LCVR氨基酸序列中：SEQIDN0:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、 186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389 和 405。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū) 01〇^)，所述重鏈可變區(qū)具有選自下組的氨基酸序列 ：5￡0 10勵(lì)：2、18、34、50、66、82、98、 114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381 和 397。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū) (LCVR)，所述輕鏈可變區(qū)具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:10、26、42、58、74、90、 106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389 和 405 〇
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自下組的 HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)：SEQIDN0 :2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、 114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、 258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389 和 397/405。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自下組的 HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)：SEQIDN0 :50/58、146/154、210/218 和 290/298。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含：
[0033] (a)HCDRl結(jié)構(gòu)域，所述HCDR1結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :4、 20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、 340、356、383 和 399 ;
[0034] (b)HCDR2結(jié)構(gòu)域，所述HCDR2結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :6、 22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、 342、358、385 和 401 ;
[0035] (c)HCDR3結(jié)構(gòu)域，所述HCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :8、 24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、 344、360、387 和 403 ;
[0036] (d)LCDRl結(jié)構(gòu)域，所述LCDR1結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :12、 28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、 348、364、391和 407 ;
[0037] (e)LCDR2結(jié)構(gòu)域，所述LCDR2結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDNO:14、 30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、 350、366、393 和 409 ;以及
[0038] (f)LCDR3結(jié)構(gòu)域，所述LCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :16、 32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、 352、368、395 和 411。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與包含選自下組 的重鏈和輕鏈序列對(duì)的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)與人GFRa3的特異性結(jié)合：SEQIDN0 : 2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、 178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、 322/330、338/346、354/362、381/389 和 397/405。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合的人GFRa3 上的表位與被包含選自下組的重鏈和輕鏈序列對(duì)的抗體所識(shí)別的相同：SEQIDNO:2/10、 18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、 194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、 338/346、354/362、381/389 和 397/405。
[0041] 本發(fā)明的抗體可以是全長(zhǎng)的（例如，IgGl或IgG4抗體）或者可以僅包含抗原結(jié) 合部分（例如，F(xiàn)ab、F(ab'）2或scFv片段），并且可以進(jìn)行修飾以影響其功能，例如消除殘 余的效應(yīng)器功能（Reddy等，2000,J.Immunol. 164:1925-1933)。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方式中，與人GFRa3特異性地結(jié)合的所述分離的抗體或其抗原結(jié)合 片段包含HVCR，所述HCVR包含三個(gè)重鏈CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重鏈CDR包含 在選自下組的HCVR氨基酸序列中：SEQIDN0:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、 178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381和 397;和/或1〇^，所述1〇^ 包含三個(gè)輕鏈⑶R(IXDR1、IXDR2和IXDR3)，所述輕鏈⑶R包含在選自下組的LCVR氨基酸 序列中：SEQIDN0:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、 266、282、298、314、330、346、362、389 和 405。用于標(biāo)識(shí)HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR 的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且其能夠用于標(biāo)識(shí)本申請(qǐng)中公開(kāi)的特定HCVR和/或LCVR 氨基酸序列中的CDR。能夠用于標(biāo)識(shí)CDR邊界的示例性的常規(guī)方法包括例如Kabat定義、 Chothia定義和AbM定義。一般而言，Kabat定義基于序列的變異性，Chothia定義基于 結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的位置，而Abm定義是介于Kabat和Chothia方法之間的折中方法。參見(jiàn)例 如Kabat,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)關(guān)注的蛋白序 列）"，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md. (1991) ;Al_Lazikani等，J.Mol. Biol. 273:927-948 (1997)和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272 (1989)。 也可以利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定抗體中CDR序列。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方式中，與人GFRa3特異性結(jié)合的所述分離的抗體或抗原結(jié)合片段 包含：
[0044] (a)HCDR3結(jié)構(gòu)域，所述HCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :8、 24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、 344、360、387 和 403 ;以及
[0045] (b)LCDR3結(jié)構(gòu)域，所述LCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDNO: 16、 32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、 352、368、395 和 411。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方式中，如上述（a)和（b)中所描述的與人GFRa3特異性結(jié)合的所述 分離的抗體或抗原結(jié)合片段還包含：
[0047] (c)HCDRl結(jié)構(gòu)域，所述HCDR1結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :4、 20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、 340、356、383 和 399 ;
[0048] (d)HCDR2結(jié)構(gòu)域，所述HCDR2結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:6、 22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、 342、358、385 和 401 ;
[0049] (e)LCDRl結(jié)構(gòu)域，所述LCDR1結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :12、 28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、 348、364、391 和 407 ;以及
[0050] (f)LCDR2結(jié)構(gòu)域，所述LCDR2結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0 :14、 30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、 350、366、393 和 409。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種全人源單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所 述抗體或其抗原結(jié)合片段與人GFRa3特異性地結(jié)合，其中所述抗體或其片段顯示出一個(gè) 或多個(gè)下述特征：（i)包含HCVR，所述HCVR具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:2、18、 34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、 354、381和397;(ii)包含LCVR，所述LCVR具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:10、26、 42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、 362、389和405 ;(iii)HCDR3結(jié)構(gòu)域，所述HCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、 328、344、360、387和403，或者與其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%的序 列一致性的基本上相似的序列；和LCDR3結(jié)構(gòu)域，所述LCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸 序列：SEQIDN0:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、 288、304、320、336、352、368、395和411，或者與其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至 少99%的序列一致性的基本上相似的序列；（iv)HCDR1結(jié)構(gòu)域，所述HCDR1結(jié)構(gòu)域具有選自 下組的氨基酸序列：SEQIDN0:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、 228、244、260、276、292、308、324、340、356、383 和 399,或者與其具有至少 90%、至少 95%、 至少98 %、或至少99 %的序列一致性的基本上相似的序列；HCDR2結(jié)構(gòu)域，所述HCDR2結(jié) 構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、 182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385 和 401，或者與其具有至少 90 %、至少95 %、至少98 %、或至少99 %的序列一致性的基本上相似的序列；IXDR1結(jié)構(gòu)域， 所述LCDR1結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:12、28、44、60、76、92、108、124、 140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391 和 407,或者與 其具有至少90 %、至少95 %、至少98 %、或至少99 %的序列一致性的基本上相似的序列； 以及LCDR2結(jié)構(gòu)域，所述LCDR2結(jié)構(gòu)域具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDN0:14、30、46、 62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、 393和409,或者與其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%的序列一致性的基 本上相似的序列；(v)通過(guò)表面等離子體共振測(cè)定顯示出的Kd范圍為約1(T8M至約1(T13M; (vi)顯示出將GFRa3與其配體artemin的結(jié)合阻斷約50-100%的能力，其IC5(I值范圍為 約40pM至約15nM; (vii)顯示出將GFRa3與使用artemin和RET的混合物涂覆的固體支 持物的結(jié)合阻斷約20%至約100%的能力；（viii)阻斷或抑制artemin依賴性RET的活化， 其IC5Q范圍為約200pM至約50nM;(ix)在骨癌疼痛體內(nèi)模型中抑制或減輕一種或多種疼痛 感受性反應(yīng)；(x)在體內(nèi)抑制或減輕artemin敏感性熱痛覺(jué)過(guò)敏；(xi)在骨關(guān)節(jié)炎體內(nèi)模 型中抑制或減輕觸誘發(fā)痛；（xii)不與RET的其他GFR共受體發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，所述抗體或 抗體的抗原結(jié)合片段包含HCDR3結(jié)構(gòu)域，所述HCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自表1中所示的那些氨 基酸序列中的任意序列，或者與其具有至少90 %、至少95 %、至少98 %、或至少99 %的序列 一致性的基本上相似的序列；和LCDR3結(jié)構(gòu)域，所述LCDR3結(jié)構(gòu)域具有選自表1中所示那些 氨基酸序列中的任意序列，或者與