用于在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法和產(chǎn)品的制作方法
【專利說明】用于在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法和產(chǎn)品
[0001] 【優(yōu)先權(quán)】
[0002] 本申請要求2012年11月1日提交的美國臨時申請No. 61/721，302、2013年3 月14日提交的美國臨時申請No. 61/785, 404和2013年7月3日提交的美國臨時申請 No. 61/842,874的優(yōu)先權(quán)，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。本申請與2012 年5月7日提交的美國申請No. 13/465, 490、2012年12月5日提交的國際申請No.PCT/ 舊2012/067966和2013年6月28日提交的美國申請此.13/931，251有關(guān)，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容 以全文引用的方式并入本文中。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明部分地涉及編碼蛋白質(zhì)的核酸，包含編碼蛋白質(zhì)的核酸的治療劑，用于誘 導(dǎo)細(xì)胞以使用核酸來表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，用于轉(zhuǎn)染、基因編輯和重編程細(xì)胞的方法、試劑盒 和器件，和使用這些方法、試劑盒和器件而產(chǎn)生的細(xì)胞、生物體和治療劑。
[0004] 【以電子方式提交的文本文件的描述】
[0005] 以電子方式與其一起提交的文本文件的內(nèi)容是以全文引用的方式并入本文中：序 列表的計算機(jī)可讀格式副本（文件名：FABI_005_02W0_SeqList_ST25.txt;記錄日期：2013 年10月30日；文件大?。?55KB)。
[0006] 【發(fā)明背景】
[0007] 【合成RNA和RNA治療劑】
[0008] 核糖核酸（RNA)普遍存在于原核和真核細(xì)胞中，其中它以信使RNA形式編碼遺傳 信息，以轉(zhuǎn)運(yùn)RNA形式結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，以核糖體RNA形式將氨基酸組裝到蛋白質(zhì)中，并 且以微RNA和長的非編碼RNA形式執(zhí)行眾多其它功能，包括基因表達(dá)調(diào)控。RNA可通過包括 直接化學(xué)合成和體外轉(zhuǎn)錄的方法合成產(chǎn)生，并且可施用至患者以用于治療用途。
[0009] 【細(xì)胞重編程和基于細(xì)胞的療法】
[0010] 可以通過使細(xì)胞暴露于特定的細(xì)胞外信號和/或通過特定蛋白質(zhì)、微RNA等的 異位表達(dá)來將細(xì)胞重編程。雖然先前已描述了若干種重編程方法，但依賴于異位表達(dá)的 大部分重編程方法需要引入外源DNA，其可能攜帶突變風(fēng)險。已報道了基于重編程蛋白 的直接遞送的無DNA的重編程方法。然而，這些方法對于商業(yè)用途來說太低效并且不可 靠。另外，已經(jīng)描述了基于RNA的重編程方法（參見例如Angel.MITThesis. 2008. 1-56; Angel等，PLoSONE. 2010. 5,107 ;Warren等，CellStemCell. 2010. 7, 618-630 ;Angel.MIT Thesis. 2011. 1-89 ;和Lee等，Cell. 2012. 151,547-558 ;其全部的內(nèi)容特此以引用的方式 并入）。然而，當(dāng)在成人細(xì)胞上進(jìn)行時，現(xiàn)有的基于RNA的重編程方法是緩慢、不可靠和低效 的，需要許多次轉(zhuǎn)染（產(chǎn)生顯著的費(fèi)用和錯誤機(jī)會），可以重編程僅有限數(shù)目的細(xì)胞類型， 可以將細(xì)胞重編程至僅有限數(shù)目的細(xì)胞類型，需要使用免疫抑制劑，并且需要使用多種人 類來源的組分，包括血源性HSA和人類成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞。先前公開的基于RNA的重編 程方法的許多缺點(diǎn)使其對于研宄和治療用途來說是不理想的。
[0011] 【基因編輯】
[0012] 若干種天然存在的蛋白質(zhì)含有可以識別特定DNA序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，鋅 指（ZF)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE)。含有一個或多個這些DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FokI 核酸內(nèi)切酶的切割域的融合蛋白可用于在細(xì)胞中的所希望DNA區(qū)域中產(chǎn)生雙鏈斷裂（參見 例如美國專利申請公開No.US2012/0064620、美國專利申請公開No.US2011/0239315、美 國專利No. 8, 470, 973、美國專利申請公開No.US2013/0217119、美國專利No. 8, 420, 782、 美國專利申請公開No.US2011/0301073、美國專利申請公開No.US2011/0145940、美國專 利No. 8, 450, 471、美國專利No. 8, 440, 431、美國專利No. 8, 440, 432和美國專利申請公開 No. 2013/0122581，其全部的內(nèi)容特此以引用的方式并入）。然而，目前用于基因編輯細(xì)胞的 方法是低效的并且?guī)в胁皇芸刂普T變的風(fēng)險，使其對于研宄和治療用途來說是不理想的。 先前尚未探討體細(xì)胞的無DNA基因編輯方法，也未探討用于對體細(xì)胞進(jìn)行同時或依序基因 編輯和重編程的方法。另外，先前尚未探討用于對患者中的細(xì)胞（即，體內(nèi)）進(jìn)行直接基因 編輯的方法，并且這些方法的發(fā)展已受到以下的限制：缺乏可接受靶標(biāo)、低效遞送、一種或 多種基因編輯蛋白的低效表達(dá)、所表達(dá)的一種或多種基因編輯蛋白的低效基因編輯、部分 地由于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不良結(jié)合、過量的脫靶效應(yīng)、部分地由于FokI切割域的非定向二 聚和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不良特異性，和其它因素。最后，先前尚未探討基因編輯在抗細(xì)菌、 抗病毒和抗癌治療中的使用。
[0013] 因此，仍需要用于在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的改進(jìn)的組合物和方法。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0014] 本發(fā)明部分地提供用于誘導(dǎo)細(xì)胞以表達(dá)蛋白質(zhì)的組合物、方法、物品和器件，用于 產(chǎn)生這些組合物、方法、物品和器件的方法、物品和器件，和使用這些組合物、方法、物品和 器件而產(chǎn)生的組合物和物品，包括細(xì)胞、生物體和治療劑。不同于先前報道的方法，本發(fā)明 的某些實(shí)施方案不包括使細(xì)胞暴露于外源DNA或者同種異體或動物源材料，這使得根據(jù)本 發(fā)明的方法制造的產(chǎn)品可用于治療應(yīng)用。
[0015] 在一些方面，提供具有低毒性和高翻譯效率的合成RNA分子。在一個方面，提供用 于細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)染、重編程和基因編輯的細(xì)胞培養(yǎng)基。其它方面涉及用于產(chǎn)生編碼重編 程蛋白的合成RNA分子的方法。其它方面涉及用于產(chǎn)生編碼基因編輯蛋白的合成RNA分子 的方法。
[0016] 在一個方面，本發(fā)明提供包含工程改造的核酸酶切割域的高效率基因編輯蛋白。 在另一個方面，本發(fā)明提供包含工程改造的核酸酶切割域的高保真基因編輯蛋白。其它方 面涉及包含工程改造的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的高效率基因編輯蛋白。其它方面涉及包含工程改 造的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的高保真基因編輯蛋白。其它方面涉及包含工程改造的重復(fù)序列的基 因編輯蛋白。一些方面涉及通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞以表達(dá)基因編輯蛋白來改變細(xì)胞的 DNA序列的方法。其它方面涉及用于改變體外培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞的DNA序列的方法。其 它方面涉及用于改變體內(nèi)存在的細(xì)胞的DNA序列的方法。
[0017] 在一些方面，本發(fā)明提供用于治療癌癥的方法，其包括向患者施用治療有效量的 基因編輯蛋白或編碼基因編輯蛋白的核酸。在一個方面，所述基因編輯蛋白能夠改變癌癥 相關(guān)基因的DNA序列。在另一個方面，所述癌癥相關(guān)基因是BIRC5基因。其它方面涉及包 含核酸和/或細(xì)胞的治療劑和使用包含核酸和/或細(xì)胞的治療劑來治療例如以下疾病的方 法：1型糖尿病、心臟病包括缺血性和擴(kuò)張性心肌病、黃斑變性、帕金森氏?。≒arkinson's disease)、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞貧血、地中海貧血、范可尼貧血（Fanconianemia)、重癥聯(lián) 合免疫缺陷、遺傳性感覺神經(jīng)病、著色性干皮病、亨廷頓氏病（Huntington'sdisease)、肌 營養(yǎng)不良癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer'sdisease)、癌癥和傳染性 疾病包括肝炎和HIV/AIDS。在一些方面，所述核酸包含合成RNA。在其它方面，使用病毒將 所述核酸遞送至細(xì)胞。在一些方面，所述病毒是有能力復(fù)制型病毒。在其它方面，所述病毒 是無能力復(fù)制型病毒。
[0018] 本發(fā)明的細(xì)節(jié)闡述于下面所附描述中。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可以使用與 本文所述類似或等效的方法和材料，但現(xiàn)在描述說明性方法和材料。根據(jù)本說明書和權(quán)利 要求書，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。在本說明書和所附的權(quán)利要求書 中，除非上下文另外明確說明，否則單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)。除非另外定義，否則本文使用的 所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。 【【附圖說明】】
[0019] 圖1A描繪在變性甲醛-瓊脂糖凝膠上離析的編碼所示蛋白質(zhì)并含有腺苷、50%鳥 苷、50% 7-脫氮鳥苷、70%尿苷、30% 5-甲基尿苷和5-甲基胞苷的RNA。
[0020] 圖1B描繪在變性甲醛-瓊脂糖凝膠上離析的編碼所示蛋白質(zhì)并含有腺苷、50%鳥 苷、50% 7-脫氮鳥苷、50%尿苷、50% 5-甲基尿苷和5-甲基胞苷的RNA。
[0021] 圖2描繪通過用編碼重編程蛋白的RNA進(jìn)行五次轉(zhuǎn)染而重編程的原代人類新生兒 成纖維細(xì)胞。將細(xì)胞固定并對0ct4蛋白染色。用Hoechst33342將核反染色。
[0022] 圖3A描繪原代人類成人成纖維細(xì)胞。
[0023] 圖3B描繪圖3A中所示的原代人類成人成纖維細(xì)胞，其通過用編碼重編程蛋白的 RNA進(jìn)行七次轉(zhuǎn)染來重編程。箭頭指不重編程細(xì)胞的集落。
[0024] 圖3C描繪重編程原代人類成人成纖維細(xì)胞的大的集落。
[0025] 圖4A描繪靶向人類CCR5基因的TALEN對的位置。單線指示TALEN結(jié)合位點(diǎn)。雙 線指示△ 32突變的位置。
[0026] 圖4B描繪在變性甲醛-瓊脂糖凝膠上離析的編碼圖4A的TALEN對的合成RNA。
[0027] 圖4C描繪測試圖4B的RNA在人類皮膚成纖維細(xì)胞（GM00609)上的功能性的 SURVEYOR測定法的結(jié)果。在從用RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的樣品中出現(xiàn)760bp和200bp條帶指 示成功的基因編輯。每個泳道下面的百分比指示基因編輯效率（所編輯的等位基因的百分 比）。
[0028] 圖4D描繪圖4C的"陰性"和"TALEN"泳道的線-輪廓圖。數(shù)字指示三個條帶相 對于總積分強(qiáng)度的積分強(qiáng)度。
[0029] 圖4E描繪如圖4C中一樣進(jìn)行并且還包括從用RNA轉(zhuǎn)染兩次的細(xì)胞產(chǎn)生的樣品的 SURVEYOR測定法的結(jié)果（條帶標(biāo)記為"2x"）。
[0030] 圖4F描繪使用合成RNA對原代人類細(xì)胞（GM00609)進(jìn)行同時的基因編輯和重編 程。圖像示出重編程細(xì)胞的代表性集落。
[0031] 圖4G描繪對如圖4F中所產(chǎn)生的基因編輯的重編程細(xì)胞中的CCR5基因進(jìn)行直接 測序的結(jié)果。所測試的9條線中的4條在TALEN結(jié)合位點(diǎn)之間含有缺失，從而指示有效的 基因編輯。
[0032] 圖5描繪如圖4C中一樣進(jìn)行的SURVEYOR測定法的結(jié)果，其中例外為使用靶向人 類MYC基因并含有標(biāo)準(zhǔn)核苷酸（"A、G、U、C"）或非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸（"A、7dG、5mU、5mC"）的 RNA。在470bp和500bp下的深色條帶指示高效率基因編輯。
[0033] 圖6描繪如圖4C中一樣進(jìn)行的SURVEYOR測定法的結(jié)果，其中例外為使用靶向人 類BIRC5基因并含有標(biāo)準(zhǔn)核苷酸（"A、G、U、C"）或非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸（"A、7dG、5mU、5mC"）的 RNA。在710bp下的深色條帶指示高效率基因編輯。
[0034] 圖7A描繪用靶向人類BIRC5基因的RNA(RiboSlice)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞（子宮頸 癌）。用單個RNA( "2X存活素L"）或相等量的每個成員的RNA對（"存活素L+R"）轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，其中在每種情況下遞送相同總量的RNA。如右圖中所示，用RNA對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞變得增 大，并且呈現(xiàn)出破碎核和顯著降低的增殖，這表明RiboSlice的有效抗癌活性。
[0035] 圖7B描繪如圖7A中一樣用靶向人類BIRC5基因的RNA轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。隨后將 細(xì)胞固定并對存活素蛋白染色。用Hoechst33342將核反染色。用箭頭指示用RiboSlice 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的大的破碎核。
[0036] 圖8描繪使用合成RNA重編程的原代人類成人成纖維細(xì)胞。箭頭指示展現(xiàn)指示重 編程的形態(tài)的細(xì)胞的密實(shí)集落。
[0037] 圖9描繪在變性甲醛-瓊脂糖凝膠上離析的編碼所示基因編輯蛋白的合成RNA。
[0038] 圖10A描繪測試圖9的RN