icprocessor.ColepParmer) 在4°C下進(jìn)行20分鐘破碎。將破碎液在13000rpm下進(jìn)行20分鐘離心分離，僅收集上清液 后，放入預(yù)先用裂解緩沖液平衡的Ni-NTA柱（Ni-NTASuperflow.Qiagen)，然后，依次流過(guò) 將在50mMTris_HC1300mMNaCl(pH8. 0)中含有20mM咪唑的緩沖液和含有200mM咪唑的緩 沖液。通過(guò)作為最終工序的50mMTris_HC1300mMNaCl(pH8.0)、200mM咪唑的流過(guò)，洗脫目 標(biāo)蛋白質(zhì)。將洗脫的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到酶活性測(cè)定緩沖溶液（50mMPIPESpH7.0)來(lái)用于下一 實(shí)驗(yàn)。
[0087] 利用該方法能夠得到部分精制的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn) 單體的大小為約33. 2千道爾頓（KD)。（參照?qǐng)D2)
[0088] (2)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的金屬離子需求性分析
[0089] 對(duì)于從上述實(shí)施例2得到的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，研宄是否受金屬離子的 影響。
[0090]分別以ImM的CuCl2、MnCl2、CaCl2、ZnS04、MgS04、NiS04、CoCl2對(duì)上述精制的酶進(jìn) 行處理，與未進(jìn)行任何處理的酶（對(duì)照組：Non)比較活性，并示于圖3。此時(shí)，就反應(yīng)而言， 50mM果糖、酶0. 5單位/ml在50mMPIPES緩沖液（pH7. 0)中在60°C下進(jìn)行5分鐘反應(yīng)， 然后進(jìn)行測(cè)定。在l〇〇°C下加熱5分鐘終止了酶活性。就酶活性而言，在含有作為基質(zhì)的 50mM果糖和ImMCo2+的50mMPIPES緩沖溶液（pH7. 0)中，在60°C下使酶反應(yīng)，將每分鐘生 產(chǎn)1ymol的阿洛酮糖的量定義為1單位（unit) 〇
[0091] 如圖3所示，可知，實(shí)施例2的酶由于錳離子和鈷離子的添加而表現(xiàn)出活性增加， 因此與以往的酶同樣地具有金屬離子需求性。
[0092] (3) D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶隨溫度、pH變化的活性分析
[0093] 為了觀察實(shí)施例2的酶隨溫度、pH變化的活性，首先在pH7下從30°C測(cè)定至 80 °C，結(jié)果如圖4所示，可知，上述酶在50至65 °C的范圍內(nèi)表現(xiàn)出高活性，特別是在60 °C下 表現(xiàn)出最大活性。
[0094] 此外，為了 了解隨pH變化的活性，在60 °C下分別使用50mM乙酸鈉（sodium acetate)pH4 ~6、50mM朽1 檬酸鈉（sodiumcitrate)pH5 ~7、50mMPIPESpH7、50mM Tris-HClpH7~9、50mM甘氨酸（glycine)NaOHpH9~10的緩沖溶液，觀察表現(xiàn)出最大活 性的pH，結(jié)果如圖5所示，在pH6.0~9.0范圍內(nèi)看到80%以上的高活性，其中，在pH7.0 時(shí)表現(xiàn)出特別高的活性。此外，可以確認(rèn)到，在對(duì)應(yīng)PH7.0的緩沖溶液中，PIPES緩沖溶液 表現(xiàn)出最大活性，在相應(yīng)緩沖溶液中看到最高活性。
[0095] 此時(shí)，活性測(cè)定是以50mM果糖、ImMCoCl2、酶0. 5單位/ml在各pH和溫度范圍下 實(shí)現(xiàn)的，在l〇〇°C下加熱5分鐘終止了酶活性。
[0096] ⑷D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的基質(zhì)特異性分析
[0097] 將50mM的果糖、阿洛酮糖、葡萄糖、木糖、塔格糖分別用作基質(zhì)，以10mM基質(zhì)、ImM CoCl2、酶0. 5單位/ml在50mMPIPES緩沖溶液pH7. 0中在60°C下反應(yīng)5分鐘，對(duì)于各基質(zhì) 測(cè)定活性程度。在l〇〇°C下加熱5分鐘終止了酶活性。
[0098]其結(jié)果如下述表1所示，在上述基質(zhì)中，僅在阿洛酮糖和果糖中看到高活性，特別 是當(dāng)與果糖的基質(zhì)特異性進(jìn)行比較時(shí)，表現(xiàn)出阿洛酮糖的基質(zhì)特異性高出約38%。以往公 知的酮糖3-差向異構(gòu)酶對(duì)塔格糖和山梨糖以及阿洛酮糖和果糖具有反應(yīng)性，與此相比，本 發(fā)明的酶具有僅對(duì)阿洛酮糖和果糖進(jìn)行特異性反應(yīng)的特征，從而可以確認(rèn)與以往公知的酶 的基質(zhì)特異性不同。
[0099][表1]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶蛋白，其具有序列號(hào)1的氨基酸序列、與所述序列號(hào) 1的氨基酸序列有70%以上同源性的氨基酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的酶蛋白，所述酶蛋白使果糖的第3個(gè)碳位差向異構(gòu)化來(lái)使其轉(zhuǎn) 變?yōu)榘⒙逋恰?br>3. 如權(quán)利要求1所述的酶蛋白，具有與所述序列號(hào)1的氨基酸序列有70%以上同源性 的氨基酸序列的酶蛋白具有選自由下述特性組成的組中的1種以上特性： (a) 單體的分子量為32至34kDa、 (b) 最佳溫度為50至65°C、及 (c) 最佳pH為6. 0至9. 0。
4. 如權(quán)利要求1所述的酶蛋白，在具有與所述序列號(hào)1的氨基酸序列有70%以上同源 性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中，選自由具有序列號(hào)1的氨基酸序列的第229個(gè)氨基酸和第264 個(gè)氨基酸組成的組中的1種以上的氨基酸被選自由賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷 氨酸組成的組中的1種以上的氨基酸取代。
5. 如權(quán)利要求4所述的酶蛋白，在具有與所述序列號(hào)1的氨基酸序列有70%以上同源 性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中，選自由具有序列號(hào)1的氨基酸序列的第229個(gè)氨基酸和第264 個(gè)氨基酸組成的組中的1種以上的氨基酸被選自由天冬氨酸和谷氨酸組成的組中的1種以 上的氨基酸取代。
6. 如權(quán)利要求5所述的酶蛋白，具有與所述序列號(hào)1的氨基酸序列有70%以上同源性 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)是具有序列號(hào)1的氨基酸序列的第229個(gè)氨基酸被谷氨酸取代的蛋 白質(zhì)、第264個(gè)氨基酸被天冬氨酸取代的蛋白質(zhì)、或氨基酸序列的第229個(gè)氨基酸被谷氨酸 取代且第264個(gè)氨基酸被天冬氨酸取代的蛋白質(zhì)。
7. 如權(quán)利要求1所述的酶蛋白，所述具有序列號(hào)1的氨基酸序列的酶蛋白來(lái)自原始介 屬密螺旋體（Treponemaprimitia)。
8. 如權(quán)利要求1所述的酶蛋白，所述酶蛋白借助選自由錳、鈷、鋅和鎂組成的組中的1 種以上的金屬離子增加活性。
9. 一種酶蛋白，其含有對(duì)序列號(hào)1的氨基酸序列、序列號(hào)2的氨基酸序列、序列號(hào)3的 氨基酸序列或序列號(hào)4的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因、或者包含所述基因的重組載體作為 有效成分。
10. 如權(quán)利要求9所述的酶蛋白，所述對(duì)序列號(hào)1的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因具有序 列號(hào)5的喊基序列，對(duì)序列號(hào)2的氣基酸序列進(jìn)彳丁編碼的基因具有序列號(hào)6的喊基序列，對(duì) 序列號(hào)3的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因具有序列號(hào)7的堿基序列，并且對(duì)序列號(hào)4的氨基 酸序列進(jìn)彳丁編碼的基因具有序列號(hào)8的喊基序列。
11. 一種重組表達(dá)載體，其包含對(duì)選自序列號(hào)1至序列號(hào)4中的任一氨基酸序列進(jìn)行編 碼的堿基序列且具有圖1的酶切圖。
12. -種重組微生物，其由包含對(duì)序列號(hào)1至序列號(hào)4中任一氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿 基序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，表達(dá)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶蛋白。
13. 如權(quán)利要求12所述的重組微生物，所述表達(dá)載體具有圖1的酶切圖。
14. 如權(quán)利要求13所述的重組微生物，所述微生物是大腸桿菌、芽孢桿菌屬菌、棒狀桿 菌屬菌或沙門(mén)氏菌屬菌。
15. 如權(quán)利要求13所述的重組微生物，所述微生物是大腸桿菌（E.coli)，其保藏號(hào)為 KCCM11295P。
16. -種用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，其包含權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的酶蛋白、 權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的重組微生物、所述重組微生物的培養(yǎng)物或所述重組微生 物的破碎物。
17. 如權(quán)利要求16所述的用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，其進(jìn)一步包含選自由錳、鈷、鋅 和鎂組成的組中的1種以上的金屬離子。
18. -種從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，其包括使權(quán)利要求16所述的用于生產(chǎn)阿洛酮糖 的組合物與果糖反應(yīng)的步驟。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，所述果糖濃度為5~60% (w/v)。
20. 如權(quán)利要求18所述的方法，所述與果糖反應(yīng)的步驟在pH6. 0至9. 0的條件下實(shí) 現(xiàn)。
21. 如權(quán)利要求18所述的方法，所述與果糖反應(yīng)的步驟在50°C至65°C的溫度條件下實(shí) 現(xiàn)。
22. 如權(quán)利要求18所述的方法，其通過(guò)所述與果糖反應(yīng)的步驟，使果糖的第3個(gè)碳位差 向異構(gòu)化來(lái)使果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋?，得到所述阿洛酮糖?br>【專(zhuān)利摘要】根據(jù)本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶為保持使果糖的第3個(gè)碳位差向異構(gòu)化來(lái)生產(chǎn)阿洛酮糖的優(yōu)異活性的酶，如果將該酶的工業(yè)有用的大范圍的pH、高溫時(shí)的穩(wěn)定性作為特征應(yīng)用于工業(yè)化，則能夠大量生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性高的阿洛酮糖，從而不僅是功能性糖工業(yè)，還可以期待在利用其的健康食品原料、醫(yī)藥用、化妝品用原料等中有效使用。KCCM11295P20120801
【IPC分類(lèi)】C12N9-90, C12P19-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104769125
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380041822
【發(fā)明人】崔禎尹, 金玟廷, 金慧貞, 樸鐘辰, 李康杓, 許振率
【申請(qǐng)人】株式會(huì)社三養(yǎng)吉尼克斯
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2013年8月9日