微膠囊組合物及方法
【專利說明】微膠囊組合物及方法 奪叉引用
[0001] 本申請要求2012年8月14日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/683, 192、2012年12 月14日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/737,374、2013年2月8日提交的美國臨時專利申 請?zhí)?1/762,435、2013年3月15日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/800, 223、2013年6月 27日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/840,403和2013年7月10日提交的美國臨時專利申 請?zhí)?61/844, 804的權益，所述臨時專利申請為所有目的在此通過引用整體并入本文。 發(fā)明背景
[0002] 分析物的檢測和量化對于分子生物學和醫(yī)學應用如診斷至關重要。遺傳檢測對于 許多診斷方法特別有用。例如，用DNA序列信息可以檢測或更準確地表征由突變引起的病 癥如癌癥。
[0003] 在進行分子反應如測序反應之前，常常需要適當?shù)臉悠分苽洹Ｆ鹗紭悠房梢允巧?物樣品，諸如細胞、組織或核酸的集合。當起始材料是細胞或組織時，樣品可能需要裂解或 以其它方式進行操作，以允許分子如DNA的提取。樣品制備還可以包括對分子進行片段化、 分離分子和/或?qū)ⅹ毺貥俗R符（identifier)附接至分子的特定片段，以及其它操作。本領 域中存在對用于在下游應用之前制備樣品的改進方法和裝置的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本公開內(nèi)容提供了用于微膠囊陣列裝置的組合物和方法。
[0005] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了包含第一微膠囊的組合物，其中：當向第一微膠囊 施加刺激時，第一微膠囊是可降解的；并且第一微膠囊包含寡核苷酸條形碼。在一些情況 下，第一微膠囊可包含化學交聯(lián)體。該化學交聯(lián)體例如可以是二硫鍵。在一些情況下，該組 合物可包含聚合物凝膠，例如，聚丙烯酰胺凝膠。第一微膠囊可包含珠粒。在一些情況下， 該珠?？梢允悄z珠粒。
[0006] 此外，所述刺激可以選自生物刺激、化學刺激、熱刺激、電刺激、磁刺激或光刺激及 其組合。在一些情況下，化學刺激可以選自pH的變化、離子濃度的變化和還原劑。該還原 劑可以是，例如，二硫蘇糖醇OTT)或三（2-羧乙基）膦（TCEP)。
[0007] 第二微膠囊可包含第一微膠囊。而且，第二微膠囊可以是微滴。在一些情況下，該 組合物還可以包含含有寡核苷酸條形碼的核酸，其中該核酸包含脫氧尿苷三磷酸（dUTP)。 在一些情況下，該組合物可包含不能接受脫氧尿苷三磷酸（dUTP)的聚合酶。而且，該組合 物可包含靶分析物，例如核酸。該核酸可以選自〇嫩、1?嫩、(1階1\(1(1階1\擴增子、合成核苷酸、 合成多核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸、cDNA、dsDNA、ssDNA、質(zhì)粒DNA、粘粒DNA、高分 子量（麗)DNA、染色體DNA、基因組DNA、病毒DNA、細菌DNA、mtDNA(線粒體DNA)、mRNA、rRNA、 tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核糖開關（riboswitch) 和病毒RNA。在一些情況下，該核酸可以是基因組DNA(gDNA)。
[0008] 此外，寡核苷酸條形碼的密度可以是至少約1，〇〇〇, 000個寡核苷酸條形碼/第一 膠囊。該寡核苷酸條形碼可以通過化學交聯(lián)體（例如二硫鍵）偶聯(lián)至微膠囊。
[0009] 本公開內(nèi)容的另一方面包括包含多個分區(qū)（partitions)的裝置，其中：所述多個 分區(qū)中的至少一個分區(qū)包含含有寡核苷酸條形碼的微膠囊；并且當向微膠囊施加刺激時， 該微膠囊是可降解的。該分區(qū)例如可以是孔（well)或微滴。在一些情況下，微膠囊包含化 學交聯(lián)體，例如二硫鍵。而且，該微膠囊可包含聚合物凝膠，例如聚丙烯酰胺凝膠。另外，該 微膠囊可以包含珠粒。在一些情況下，該珠?？梢允悄z珠粒。
[0010] 所述刺激可以選自生物刺激、化學刺激、熱刺激、電刺激、磁刺激或光刺激及其組 合。在一些情況下，化學刺激可以選自pH的變化、離子濃度的變化和還原劑。該還原劑例 如可以是二硫蘇糖醇0TT)或三（2-羧乙基）膦（TCEP)。
[0011] 此外，核酸可以包含寡核苷酸條形碼且該核酸可包含脫氧尿苷三磷酸（dUTP)。在 一些情況下，所述分區(qū)可以包含不能接受脫氧尿苷三磷酸（dUTP)的聚合酶。另外，該分區(qū) 可以包含靶分析物，例如核酸。該核酸可以選自DNA、RNA、dNTP、ddNTP、擴增子、合成核苷 酸、合成多核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸、cDNA、dsDNA、ssDNA、質(zhì)粒DNA、粘粒DNA、高 分子量（MW)DNA、染色體DNA、基因組DNA、病毒DNA、細菌DNA、mtDNA(線粒體DNA)、mRNA、 rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核糖開關和病毒 RNA。在一些情況下，該核酸可以是基因組DNA(gDNA)。該寡核苷酸條形碼可以通過化學交 聯(lián)體偶聯(lián)至微膠囊。在一些情況下，該化學交聯(lián)體可以是二硫鍵。
[0012] 本公開內(nèi)容的又一方面提供了用于樣品制備的方法，該方法包括將包含寡核苷酸 條形碼和靶分析物的微膠囊合并至分區(qū)中，其中當向微膠囊施加刺激時，該微膠囊是可降 解的；以及向微膠囊施加刺激，以將寡核苷酸條形碼釋放至靶分析物。該分區(qū)可以是，例如， 孔或微滴。在一些情況下，微膠囊可包含聚合物凝膠，例如聚丙烯酰胺。另外，該微膠囊可 包含珠粒。在一些情況下，該珠?？梢允悄z珠粒。此外，該微膠囊可包含化學交聯(lián)體，例 如二硫鍵。
[0013] 所述刺激可以選自生物刺激、化學刺激、熱刺激、電刺激、磁刺激或光刺激及其組 合。在一些情況下，該化學刺激可以選自pH的變化、離子濃度的變化和還原劑。該還原劑 可以是，例如，二硫蘇糖醇0TT)或三（2-羧乙基）膦（TCEP)。
[0014] 此外，核酸可以包含寡核苷酸條形碼且該核酸可包含脫氧尿苷三磷酸（dUTP)。在 一些情況下，所述分區(qū)可以包含不能接受脫氧尿苷三磷酸（dUTP)的聚合酶。而且，該方法 還可以包括將寡核苷酸條形碼附接至靶分析物。該附接可以通過例如核酸擴增反應來完 成。此外，分析物可以是核酸。在一些情況下，該核酸可以選自〇嫩、1?嫩、(1階1\(1(1階1\擴增 子、合成核苷酸、合成多核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸、〇0嫩、(1如嫩、％0嫩、質(zhì)粒0嫩、 粘粒DNA、高分子量（MW) DNA、染色體DNA、基因組DNA、病毒DNA、細菌DNA、mtDNA (線粒體 DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核糖 開關和病毒RNA。在一些情況下，該核酸可以是基因組DNA(gDNA)。而且，寡核苷酸條形碼 可通過化學交聯(lián)體偶聯(lián)至微膠囊。在一些情況下，該化學交聯(lián)體可以是二硫鍵。
[0015] 本公開內(nèi)容的又一方面提供了包含可降解凝膠珠粒的組合物，其中該凝膠珠粒包 含至少約1，〇〇〇, 〇〇〇個寡核苷酸條形碼。在一些情況下，這1，〇〇〇, 〇〇〇個寡核苷酸條形碼 是相同的。 援引并入
[0016] 在本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均為所有目的通過引用而全文 并入本文，且其程度等同于具體地和單獨地指出各個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^ 引用并入本文。
【附圖說明】
[0017] 本公開內(nèi)容的裝置的新穎特征在所附的權利要求中具體闡述。通過參考以下對其 中利用了本發(fā)明裝置的原理的說明性實施方案加以闡述的詳細描述和附圖，將會獲得對本 公開內(nèi)容的特征和優(yōu)點的更好理解，附圖中：
[0018] 圖1A是微膠囊或內(nèi)部試劑微滴的示意圖。
[0019] 圖1B是包含多個內(nèi)部試劑微滴的微膠囊的示意圖。
[0020] 圖2A是示例性微膠囊陣列的俯視圖的圖示。
[0021] 圖2B是微膠囊陣列的示例性側視圖的圖示。
[0022] 圖3是在96孔板支持物上的多微膠囊陣列配置的示意圖。
[0023] 圖4A是在微孔膠囊陣列的一個微孔中的反應順序的示意流程圖。
[0024] 圖4B類似于圖4A，不同之處在于其中注釋有可以在每個步驟中進行的方法的實 例。 發(fā)明詳沭
[0025] 雖然本文已顯示并描述了本發(fā)明的多種實施方案，但是對本領域技術人員來說顯 而易見的是，這些實施方案僅作為實例來提供。本領域技術人員在不脫離本發(fā)明的情況下 可想到許多變化、改變和替換。應當理解，可以采用本文所述的本發(fā)明實施方案的各種替代 方案。 I.總體概述
[0026] 本公開內(nèi)容提供了微孔或其它分區(qū)膠囊陣列裝置以及使用這類裝置的方法。通 常，該裝置是分區(qū)（例如，微孔，微滴）的組裝體，該分區(qū)加載有微膠囊，通常以特定的微膠 囊/分區(qū)的濃度加載。
[0027] 所述裝置可特別適用于執(zhí)行樣品制備操作。在一些情況下，裝置將樣品（例如，核 酸的不均勻混合物，細胞的混合物，等等）細分成多個分區(qū)，使得僅樣品的一部分存在于各 個分區(qū)中。例如，可以對包含核酸混合物的核酸樣品進行分割（partition)，使得在各個分 區(qū)中存在不超過核酸的一條鏈（或一個分子）。在其它實例中，可以對細胞樣品進行分割， 使得在各個分區(qū)中存在不超過一個細胞。
[0028] 分割步驟之后，可以在裝置內(nèi)對細分的樣品進行許多不同操作中的任何操作。分 區(qū)可以包含含有一種或多種試劑（例如，酶、獨特標識符（例如，條形碼）、抗體等）的一個 或多個膠囊。在一些情況下，所述裝置、配套裝置或用戶提供觸發(fā)（trigger)，該觸發(fā)使微 膠囊將一種或多種試劑釋放至相應的分區(qū)中。試劑的釋放可以使試劑能夠與細分的樣品接 觸。例如，如果該試劑是獨特標識符，例如條形碼，則該樣品可以用獨特標識符標記。標記 后的樣品隨后可以用于下游應用，如測序反應。
[0029] 在本文公開的裝置內(nèi)可進行多種不同的反應和/或操作，包括但不限于：樣品分 害J、樣品分離、結合反應、片段化（例如，在分割之前或分割之后）、連接反應和其它酶反應。 該裝置還可以用于多種不同的分子生物學應用，包括但不限于：核酸測序、蛋白質(zhì)測 序、核酸量化、測序優(yōu)化、檢測基因表達、量化基因表達以及基因組標記物或表達的標記物 的單細胞分析。此外，該裝置具有許多醫(yī)學應用。例如，它可用于包括癌癥在內(nèi)的多種遺傳 性和非遺傳性疾病和病癥的鑒定、檢測、診斷、治療、分期或風險預測。 II.微膠囊
[0030] 圖1A是示例性微膠囊的示意圖，該微膠囊包含被第二層130包封的內(nèi)部隔室120， 第二層130被固體的或半滲透性的殼或膜110封裝。通常，該殼將內(nèi)部隔室與它們的直接 環(huán)境（例如，微孔的內(nèi)部）隔開。內(nèi)部隔室，例如120、130,可包含材料，例如試劑。如圖1A 所示，試劑100可以存在于內(nèi)部隔室120中。然而，在一些情況下，試劑位于包封層130中 或位于這兩個隔室中。通常，在引入特定觸發(fā)之后，微膠囊可以釋放內(nèi)部材料或其一部分。 該觸發(fā)可導致殼層110和/或內(nèi)部包封層130的破壞，從而使內(nèi)部隔室100、120與外部環(huán) 境如微孔的空腔接觸。
[0031] 該微膠囊可包含若干流體相并且可以包含乳液（例如，油包水乳液、水包油乳 液）。微膠囊可包含與包封內(nèi)層的第二層130不混溶的內(nèi)層120。例如，內(nèi)層120可以包含 水性流體，而包封層130可以是非水性流體，如油。相反地，內(nèi)層120可以包含非水性流體 (例如，油）而包封層130可以包含水性流體。在一些情況下，微膠囊不包含第二包封層。 通常，微膠囊被殼層110進一步封裝，殼層110可以包含聚合物材料。在一些情況下，微膠 囊可包含微滴。在一些情況下，微膠囊可以是微滴。
[0032] 微滴和微滴生成方法例如在第RE41，780號美國專利中描述，該專利為所有目的 通過引用而全文并入本文。該裝置還可以包含微流體元件，該微流體元件能夠使樣品和/ 或微膠囊穿過該裝置流動并使樣品和/或微膠囊在分區(qū)內(nèi)分布。
[0033] 該微膠囊可包含多個隔室。該微膠囊可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000 或 50000 個隔室。在其它 情況下，該微膠囊包含少于 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、 500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、 8000、8500、9000、9500、10000或50000個隔室。類似地，各個隔室或其子集也可以細分成 多個額外的隔室。在一些情況下，各個隔室或其子集細分成至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、 4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000或50000個隔室。在 其它情況下，各個隔室或者其子集進一步細分成少于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000 或 50000 個隔室。
[0034] 在多個隔室中存在試劑的多種可能的分布。例如，各個隔室（或隔室總數(shù)的某 一百分比）可包含相同的試劑或相同的試劑組合。在一些情況下，各個隔室（或隔室總數(shù) 的某一百分比）包含不同的試劑或不同的試劑組合。
[0035] 隔室可以以多種方式配置。在一些情況下，微膠囊可包含通常被不混溶層隔開的 多個同心隔室（包含前面的隔室的隔室的重復單元）。在這樣的微膠囊中，試劑可以存在于 交替的隔室中、每第三個隔室中或每第四個隔室中。
[0036] 在一些情況下，大多數(shù)具有微膠囊的隔室不是同心的；相反，它們在微膠囊內(nèi)作為 單獨的、自包含的實體存在。圖1B示出了包含多個較小微膠囊140的微膠囊的實例，各個 較小微膠囊140包含試劑。如同本文所述的許多其它微膠囊，微膠囊可以被外殼封裝，該外 殼通常包含聚合物材料150。在較大的微膠囊內(nèi)封裝的多個較小微膠囊可以被不混溶流體 160在物理上分隔，從而在施加刺激并將試劑釋放至溶液中之前防止試劑的混合。在一些 情況下，該不混溶流體加載有額外的材料或試劑。在一些情況下，多個較小微膠囊被一層不 混溶流體（例如，170)包圍，該不混溶流體層進一步被與微膠囊的內(nèi)部流體混溶的流體160 包圍。例如，內(nèi)部微膠囊180可包含被不混溶（例如，油）層包封的水性內(nèi)部，該不混溶層 進一步被水性層160包圍?？苫烊芨羰遥ɡ?，160和180)可各自包含試劑。