,IzardJ,等人 PLoSComputBiol, 2012)。
[0068] 在本發(fā)明上下文中，"共變的（covariant) "基因與本發(fā)明中公開的代表性基因具 有至少0. 45、更優(yōu)選0. 5、并且甚至更優(yōu)選0. 6的最小Pearson相關(guān)性。
[0069] 在優(yōu)選的實施方式中，所述等價基因是屬于相同細菌簇的共變基因。
[0070] 如此處所用，"基因簇"或"簇"是指一系列的等價基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉 可以用來鑒定這些等價基因簇的方法（QinJ，LiY，CaiZ，LiS，ZhuJ，ZhangF等人Nature，2012)。所述簇可含有數(shù)百的細菌基因，優(yōu)選如上定義的共變基因。簡單起見，在本 申請中針對每一個簇僅鑒定了這種共變基因中的五個。每一個簇中，和來自簇的大多數(shù)基 因顯著相關(guān)的基因（最小Pearson相關(guān)性>0.7)被指定為簇的代表性基因。這些代表性 基因是例如SEQIDN0:1、SEQIDN0:6、SEQIDN0:11、SEQIDN0:16、SEQIDN0:21、SEQ IDN0:26,SEQIDN0:3USEQIDNO：36,SEQIDN0:4USEQIDN0:46,SEQIDN0:5USEQ IDN0:56,SEQIDN0:6USEQIDN0:66,SEQIDN0:7USEQIDN0:76,SEQIDN0:8USEQ IDN0:86、SEQIDN0:91、SEQIDN0:96、SEQIDN0:101、SEQIDN0:106、SEQIDN0:111、 SEQIDNO:116、SEQIDNO:121、SEQIDNO:126、SEQIDNO:131、SEQIDNO:136、SEQID NO: 141、SEQIDNO: 146和SEQIDNO: 151。各簇中的所有其它基因"等價"于這些代表性 基因。因此，簇含有一個代表性基因和數(shù)百的等價基因，它們所有都被視為是共變基因。
[0071] 如此處所用，"等價基因標記"是包含除代表性基因以外的等價基因的基因標記， 或是包含取代代表性基因的等價基因的基因標記，其中等價基因賦予本發(fā)明方法相同的性 能。這些等價基因在上面已描述。在優(yōu)選的實施方式中，等價基因標記含有屬于兩個不同 簇的至少兩個基因。在另一優(yōu)選的實施方式中，等價基因標記含有僅屬于一個簇的至少兩 個不同的基因。等價基因標記可含有代表性基因（SEQIDN0:l、6、ll、16等）及其等價基 因的混合物、或者只有等價基因。它也可能含有簇的所有等價基因?；蛘撸珊信c簇的 幾個或所有等價基因相關(guān)的信號的算術(shù)或幾何平均。
[0072] 所謂"包含"意指基因標記可進一步包含任何其它基因，在其中特定的基因不顯著 影響本發(fā)明基因標記的基本特征（因此，和術(shù)語"基本上由...組成"的含義重疊）。相反， 所謂"由...組成"意指所分析的基因標記中不存在其它基因。
[0073] "參考標記"是一種預(yù)定的基因標記，從一個或者幾個已知患有炎癥相關(guān)疾病的受 試者的生物樣本獲得。在具體的實施方式中，用于與測試樣本進行比較的參考標記獲自受 試者的生物樣本，其中受試者已可靠且明確地診斷（例如，通過肝臟活檢的方式）為患有炎 性疾病，尤其是肝臟疾病如單純性脂肪變性（"脂肪變性參考樣本"）或者NASH( "NASH參 考樣本"），和/或獲自已被診斷為患有NASH和纖維化的受試者的生物樣本（"纖維化參考 樣本"），和/或獲自已被診斷為克羅恩病且已知疾病活性的受試者的生物樣本（"克羅恩 病參考樣本"）。因此，參考標記包含或者由在所述參考樣本上已被確定的細菌基因的表達 和/或豐度組成。優(yōu)選地，這些信息獲自足夠數(shù)量的受試者，通常針對肝臟疾病的各個階段 (單純性脂肪變性/NASH/纖維化）使用不同患者的96個樣本，針對肝臟疾病的各個階段使 用另一組不同患者的145個樣本，以及使用另一組不同疾病狀態(tài)的118個克羅恩病患者樣 本。
[0074] 將測試受試者的基因標記與參考標記進行"比較"，是指從測試受試者收集生物樣 本、提取其基因組物質(zhì)RNA或者DNA、采用適當?shù)姆椒?、分別估計各基因的表達或相對豐度、 以及將標記中各基因的表達和/或豐度分別與參考標記（并非優(yōu)選）中相同基因的表達和 /或豐度進行比較、或者使用基于參考樣本或者標記經(jīng)過校準的算法，將診斷或者預(yù)后結(jié)果 附加至（affect. ..to)測試樣本。在具體的實施方式中，根據(jù)所選擇的算法，算法可給出一 個值，然后將這個值與預(yù)定參考值比較（例如，通過邏輯回歸）。這種比較需要如下面所述 的數(shù)學(xué)和統(tǒng)計方法，以便提取出區(qū)別于參考標記的特征（例如，基因），其經(jīng)過歸納總結(jié)后 用于診斷或者預(yù)后目的。
[0075] 如此處所用，術(shù)語"參考值"（或"對照值"）是指可用于鑒定與結(jié)果的類別（例如， 單純性脂肪變性、NASH或者NASH相關(guān)纖維化、穩(wěn)定或者不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩病活性）相關(guān) 聯(lián)的患者的特定值或者數(shù)據(jù)集。如前面所提到的，所述參考或者對照值獲自被明確診斷為 確定病理的患者或患者庫（pool)的歷史表達和/或豐度數(shù)據(jù)。這種參考或者對照值是預(yù)定 值，其可以采取多種形式。它可以是單截斷值，比如中位或者平均值。它可以是單個數(shù)字， 等同地適用于每一個個體患者，或者它可以隨著患者的特定亞群而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員 采用任何上述計算模型能夠輕易地確定這種參考值。
[0076] 如此處所用，"用于確定基因標記的試劑"表示允許特異性地確定所述基因標記的 試劑或者一組試劑，即專門用于特異性地確定基因標記之內(nèi)所含基因的豐度和/或表達水 平。例如，這些試劑可以是能夠與包括在基因標記之內(nèi)的mRNA、DNA或cDNA進行特異性雜 交的核酸引物或者探針。或者，它們可以是抗體或者酶，其特異性識別包括在基因標記之內(nèi) 的基因所產(chǎn)生的蛋白。這種定義不包括用于確定任何基因的基因標記的通用試劑，如Taq 聚合酶或者擴增緩沖液，盡管這種試劑也可被包含在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中。
[0077] 在本發(fā)明上下文中，如果試劑展現(xiàn)出閾值水平的結(jié)合活性、和/或2)它和已知的 相關(guān)分子沒有顯著的交叉反應(yīng)，那么試劑（例如，探針、引物或者抗體）對于其靶標而言是 "特異性的"或者"特異性識別"其靶標。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地確定所述結(jié)合親和性 (affinity)〇 [0078] 發(fā)明詳述
[0079] Flavell等人（Nature，2012)近期的研宄結(jié)果在小鼠研宄的基礎(chǔ)上提供了炎性 體、腸道微生物群和NAFLD之間關(guān)聯(lián)性的證據(jù)。這些結(jié)果鞏固了先前的公布，確立了腸道微 生物群的生態(tài)失調(diào)加劇肝臟的脂肪變性并控制NAFLD的進展速度。
[0080] 本發(fā)明人推測患者糞便中代表特定腸道微生物群的組成或改變（所謂的生態(tài)失 調(diào)）的特定細菌基因的存在將成為有用的信息，并能夠與肝臟相關(guān)代謝性疾病如NASH或者 纖維化相關(guān)聯(lián)。
[0081] Sokol等人（IBD，2009)的研宄確立了腸道微生物群是炎性腸疾病（IBD)的病理核 心。幾個其它研宄表明腸道微生物群失衡與IBD相關(guān)（相對于健康對照），并且還與疾病活 性和疾病預(yù)后相關(guān)（Sokol2008,Morgan2012,Willing2010)。
[0082] 本發(fā)明人通過對收集自患者的一些糞便樣本中細菌基因的宏基因組學(xué)基因豐度 進行定量來進行分析，其中所述患者近期的肝臟活檢是可獲得的，或者患者的克羅恩病活 性得以監(jiān)測。
[0083] 在代謝性脂肪性肝病中，在患有脂肪變性（N= 29)或患有伴纖維化的脂肪性肝炎 (N= 33)或者不伴纖維化的脂肪性肝炎（N= 34)的患者組之間進行宏基因組比較，促使其 鑒定了用于區(qū)分這些患者的宏基因組標記。
[0084] 隨后在大量的經(jīng)歷了肝臟活檢的患者糞便樣本上驗證這些區(qū)分性的基因標記，其 中有些患者處于疾病的不同階段。
[0085] 在IBD中，在穩(wěn)定的低活性疾?。∟= 20)或者不穩(wěn)定疾?。∟= 98)的克羅恩病 患者組之間進行宏基因組比較，促使其鑒定了用于區(qū)分這兩類患者的宏基因組標記。
[0086] 因此，鑒定了在NAFLD不同階段之間以及在克羅恩病患者的不同疾病活性狀態(tài)之 間的豐度差異的一些基因。重要的是，這些基因的豐度可能與疾病未來的發(fā)展關(guān)聯(lián)（例如， 肝臟組織學(xué)上發(fā)展為改進或者惡化）。
[0087] 更精確地說，已發(fā)現(xiàn)14個基因簇通常和良性脂肪變性或者克羅恩病的穩(wěn)定狀態(tài) 相關(guān)，以及發(fā)現(xiàn)7個基因簇和更晚期的肝臟疾?。∟ASH、纖維化、肝硬化）相關(guān)。此外，發(fā)現(xiàn) 8個基因簇和不伴有纖維化的NASH高度相關(guān)，以及發(fā)現(xiàn)2個基因簇和NASH相關(guān)的纖維化相 關(guān)。因此，最小數(shù)目基因的一些組合被提出作為良性脂肪變性、或者伴有或不伴有纖維化的 NASH或者克羅恩病活性的預(yù)測。
[0088] 此外，發(fā)現(xiàn)4個基因簇（簇1、31、19和11)和良性脂肪變性高度相關(guān)，以及發(fā)現(xiàn)3 個基因簇（簇1、31和19)和穩(wěn)定的克羅恩病高度相關(guān)。
[0089] 重要的是要注意，本發(fā)明的方法不僅允許診斷特定的炎性疾病階段，還允許預(yù)后 患有所述炎性疾病尤其是肝臟疾病或者克羅恩病的患者陽性或陰性的結(jié)果。
[0090] 這可以作如下解釋。在嬰兒期獲得腸道微生物群（0-3歲之間）。宿主的免疫系統(tǒng) 在選擇明確的核心微生物群時具有關(guān)鍵作用，核心微生物群對于每個個體而言（在其組成 方面）是特異性的，并且隨著時間保持穩(wěn)定。隨著時間以及整個生命期間所觀察到的核心 微生物群穩(wěn)定性，獨立于飲食結(jié)構(gòu)的改變并且可反彈（即，醫(yī)源性破壞后進行恢復(fù)）。鑒于 這種穩(wěn)定性和反彈性，核心微生物群的特征（組成、豐富程度、多樣性）與明確的炎癥誘導(dǎo) 的代謝紊亂有關(guān)，并且存在于病理發(fā)作時和貫穿整個疾病的演變期間。因此，有可能通過在 疾病進程的某個時間點簡單地分析所述患者的腸道微生物群，從而預(yù)后脂肪肝是否會進展 為晚期肝臟損傷如脂肪性肝炎、纖維化或者肝硬化，或者是否會在患者的整個生命期間保 持良性。
[0091] 重要的另一點是，腸道微生物群在控制腸道屏障功能特別是其透過性中具有關(guān)鍵 作用。腸道微生物群組成的變化，導(dǎo)致腸道屏障功能改變、促進細菌移位（在血液中存在細 菌及其成分）以及導(dǎo)致代謝性內(nèi)毒素血癥（在血液中存在內(nèi)毒素），而這些開啟了炎癥的 進展。因此，炎癥誘導(dǎo)的紊亂如糖尿病、高血壓、高膽固醇血癥、炎性腸疾病和肝臟疾病，最 初是受到受損腸道通透性的驅(qū)動，而受損腸道通透性是腸道微生物群的組成改變所觸發(fā)的 (CaniP.，Gutmicrobes, 2012)。因此，目的在于診斷、監(jiān)測或預(yù)測肝臟疾病演變的基于腸 道微生物群分析的測試，也可能用于診斷、監(jiān)測或預(yù)測任何其它炎癥相關(guān)的紊亂（即，糖尿 病、高血壓、高膽固醇血癥、炎性腸疾病和心血管疾?。?。
[0092] 第一方面，因此本發(fā)明涉及一種用于體外診斷或預(yù)后受試者中炎性疾病的方法， 包括如下步驟：
[0093] a)從所述受試者的生物樣本中確定包含或者由一個細菌基因優(yōu)選至少兩個細菌 基因組成的基因標記，
[0094] b)將獲得的基因標記與至少一個參考基因標記進行比較，
[0095]c)通過所述比較，確定所述受試者的表型。
[0096] 這種方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的診斷或者預(yù)后方法，因為它是非侵入性的、經(jīng)濟上可接 受的、且呈現(xiàn)高靈敏度和高特異性。
[0097] 在一個實施方式中，本發(fā)明的方法也可用于預(yù)測患有炎性疾病的患者的結(jié)局。
[0098] 在優(yōu)選