制備林蛙皮膠原蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是涉及制備膠原蛋白的方法，更具體地，本發(fā)明涉及制備林蛙皮膠原蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的三螺旋纖維蛋白質，其分子結構十分穩(wěn)定，主要存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌鍵、韌帶和血管中，約占哺乳動物體內蛋白質總量的25%?30%，是結締組織極重要的結構蛋白質，起著支撐器官、保護機體的作用。有資料報道，膠原蛋白能有效增強人體皮膚組織細胞的儲水能力，改善皮膚的彈性，舒緩皺紋；可促進骨的形成，增強低鈣水平下的骨膠原結構，從而提高骨強度，預防骨質疏松癥；可吸附腸道中的毒素和重金屬，降低血清甘油三酯(TG)和膽固醇(TC);可用于制備手術縫合線、止血纖維或海綿、代血漿、人工血管、心臟瓣膜和人工皮膚等。此外，膠原含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸等中性和酸性氨基酸，生物可降解，具有優(yōu)良的生物相容性與加工適應性、低免疫原性，這些均使得其在食品領域、化妝品領域、生物醫(yī)學領域得到了廣泛的應用。
[0003]目前，膠原蛋白制品主要是從一些陸生脊椎動物，如牛、豬、雞等的皮膚、軟骨、肌腱中提取。然而，近年來，由于瘋牛病、口蹄疫、禽流感等動物傳染性疾病全球肆虐，再加上部分國家與民族的宗教和習俗限制，人們開始尋求從低等脊椎動物和無脊椎動物中提取膠原蛋白。研宄表明，蛙皮中含有豐富的膠原蛋白，可作為膠原蛋白的一種潛在替代來源。
[0004]中國林娃(Rana Chensinensis)又稱哈什蟆，屬兩棲綱，無尾目，娃科，娃屬，為我國特有的國家二級保護動物，主要生長在東北、華北及西部地區(qū)，是集藥用、食補、美容于一體的珍貴蛙種，在我國具有悠久的藥用歷史，其干燥的輸卵管是我國特產的I種具有滋補強壯作用的珍貴動物性中藥材一蛤蟆油。近年來，隨著人工養(yǎng)殖技術的成熟和完善，林蛙養(yǎng)殖量和商品量逐年增加，其資源十分豐富。據不完全統計，東北地區(qū)年產林蛙10億余只，蛙油產量約200t，蛙油年產值10億元左右。然而，蛙油僅占整蛙的15%。如將其它部位(腦、皮、肉和骨)作為廢棄物或飼料處理，不僅會造成嚴重的資源浪費、而且會產生嚴重的環(huán)境污染。林蛙皮中含有豐富的蛋白質、氨基酸、膠原蛋白、抗菌肽和透明質酸等生物活性物質。近年來活體取蛙油技術的應用不僅能夠獲取良好品質的林蛙油，還能最大限度地保持林蛙活體各部位的生物活性。因此利用廢棄的林蛙皮提取膠原蛋白可以在充分利用廢棄生物資源的同時開發(fā)出高附加值的產品，具有重要的環(huán)境效益和經濟效益。
[0005]至今為止國內外關于中國林蛙深加工的研宄報道多集中于林蛙油、蛙體的制藥及蛙肉的食用，有關林蛙皮的研宄報道很少，袁德云等從林蛙皮中分離出了抗菌肽，王戰(zhàn)勇等進一步探討了林蛙皮抗菌肽對革蘭氏陽性、陰性細菌和真菌的抗菌作用；呂玲玲等研宄了林蛙皮的抗氧化性；邱芳萍等采用柱前衍生RP-HPLC法測定了林蛙皮膠原蛋白肽中18種氨基酸的含量。也有部分研宄者對林蛙皮中膠原蛋白進行了提取，如呂玲玲等應用木瓜蛋白酶在室溫下提取了林蛙皮膠原蛋白；王長周等應用堿性蛋白酶法在50°C下提取了林蛙皮膠原蛋白肽；張根生利用堿性蛋白酶等在50°C下提取了林蛙殘體膠原蛋白；李琳琳等應用胃蛋白酶在37 °C的條件下提取了林蛙皮膠原蛋白。
[0006]然而，目前制備林蛙皮膠原蛋白的技術仍有待改進。

【發(fā)明內容】

[0007]現有制備林蛙皮膠原蛋白的方法采用的溫度較高，制備條件劇烈，制備的膠原蛋白提取產物多為明膠和水解膠原蛋白，對于具有生物活性的天然膠原的提取報道很少。雖然天然膠原、明膠及水解膠原蛋白具有同源性，但它們在結構和性能上卻有很大的差異:
(I)天然膠原保持了其本身的三股螺旋結構，相對分子質量為30萬，而明膠已不具有三股螺旋結構，其相對分子質量分布從幾萬到10萬，水解膠原蛋白則是多肽的混合物，其相對分子質量分布從幾千到幾萬；(2)結構上的不同造成了它們性能上的差異，其中最為顯著的差異是天然膠原能促進細胞粘附和生長，具有顯著生物活性，而明膠和水解膠原蛋白因不具有促進細胞生長的能力，故它們不具有生物活性。
[0008]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。
[0009]根據提取介質的不同，提取膠原蛋白的傳統方法主要劃分為5種:酶法提取、酸法提取、鹽法提取、堿法提取和熱水法提取。傳統的提取方法雖然有些已經很成熟，但是提取率低、提取溫度高且提取時間較長，易造成膠原蛋白的水解、結構的破壞和生物活性的降低。1986年，Ganzler等報道了利用微波能從土壤、種子、食品、飼料中萃取分離各種類型化合物的樣品制備新方法一微波萃取法。微波萃取法問世以來，由于其選擇性高、萃取效率高、節(jié)約能源等優(yōu)點而深受重視，應用范圍從環(huán)境分析一直擴展到食品、化工、農業(yè)等領域，近年來，微波提取技術在蛋白質的提取中也有諸多應用，利用微波處理縮短提取時間，提高蛋白質得率的優(yōu)越性已在許多研宄結果中得到支持。故本發(fā)明采用酸酶法與微波萃取法相結合在低溫條件下制備林蛙皮膠原蛋白，提出了一種制備林蛙皮膠原蛋白的方法，利用該方法，能夠提高膠原蛋白提取率，縮短提取時間，并且由于提取條件溫和，所以不會破壞蛋白的活性，制得的膠原蛋白的生物活性好。
[0010]根據本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種制備林蛙皮膠原蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:(I)獲取新鮮剝離的林蛙皮，除去皮下組織及粘連物，清洗，室溫干燥，粉碎，以便獲得林蛙皮粉；(2)稱取所述林蛙皮粉10g，進行脫色和脫脂處理，以便獲得預處理的林蛙皮樣品；⑶將所述預處理的林蛙皮樣品加入至100?500mL 1.0moI/L的醋酸溶液中，以便獲得含有林蛙皮樣品的醋酸溶液，將所述含有林蛙皮樣品的醋酸溶液置于200?800W功率的微波下，輻照I?1min后，將經過微波處理的含有林蛙皮樣品的醋酸溶液持續(xù)攪拌24?48h，離心，以便獲得第一沉淀和含有酸溶性膠原蛋白的溶液和；(4)將所述第一沉淀分散于100?500mL含有0.01重量％?2重量％胃蛋白酶的1.0moI/L的醋酸溶液中，以便獲得第一溶液，將所述第一溶液進行離心以便獲得第一上清液，將所述第一上清液進行透析后，以便獲得第一透析液，將所述第一透析液進行離心以便獲得第二沉淀，將所述第二沉淀溶于100?300mL 1.0moI/L的醋酸溶液中，以便獲得含有酶溶性膠原蛋白的溶液；(5)向所述含有酸溶性膠原蛋白的溶液和所述含有酶溶性膠原蛋白的至少之一中添加NaCl，直至NaCl終濃度為0.7mol/L,以便獲得第二溶液，攪拌6?12h后，靜置12?24h后，再加入NaCl和三羥甲基氨基甲烷，直至NaCl終濃度為2.4?3mol/L，三羥甲基氨基甲烷終濃度為0.lmol/L，以便獲得第三溶液；(6)將所述第三溶液的pH值調節(jié)至7.0?7.5，攪拌6?12h，靜置12h，離心，以便獲得第三沉淀，將所述第三沉淀溶解于50?300mL 1.0mol/L的醋酸溶液中，以便獲得第四溶液，將所述第四溶液進行透析直至pH為中性，以便獲得第五溶液；(7)將所述第五溶液經-20°C過夜預凍后，真空冷凍干燥，以便獲得林蛙皮膠原蛋白。利用該方法，能夠提高膠原蛋白提取率，縮短提取時間，并且由于提取條件溫和，所以不會破壞蛋白的活性，制得的膠原蛋白的生物活性好。
[0011]根據本發(fā)明的一個實施例，所述方法中步驟(2)中的所述脫色脫脂包括以下步驟:(2-1)將所述林蛙皮粉1g加入至100?500mL 0.3mol/L的NaOH溶液中，持續(xù)慢速攪拌24?120h，每4?8h更換新鮮的所述NaOH溶液，離心，以便獲得經過NaOH溶液處理的林蛙皮樣品，任選地，所述NaOH溶液中含有O %?3 %過氧化氫；(2-2)將所述NaOH溶液處理的林蛙皮樣品用10倍體積的4°C蒸餾水洗滌樣品至中性，以便獲得水洗至中性的林蛙皮樣品；(2-3)將所述水洗至中性的林蛙皮樣品加入至100?500mL 20%的正丁醇溶液中，持續(xù)攪拌24?72h，每4?8h更換新鮮的所述正丁醇溶液，離心，以便獲得經過正丁醇溶液處理的林蛙皮樣品；(2-4)將所述經過正丁醇溶液處理的林蛙皮樣品用10倍體積4°C的蒸餾水洗滌三次，以便獲得所述預處理的林蛙皮樣品。利用該方法，能夠進一步提高膠原蛋白提取率并且保證膠原蛋白的生物活性。
[0012]根據本發(fā)明的一個實施例，所述方法在步驟⑷之前，步驟(3)之后，進一步包括:將所述第一沉淀的至少一部分加入到100?500mL 1.0moI/L的醋酸溶液中，并將所得到的混合物置于200?800W功率的微波下，福照I?1min后，將經過福照處理的混合物持續(xù)攪拌24?48h，離心，以便獲得第四沉淀和含有酸溶性膠原蛋白的溶液，其中，將所述第四沉淀和所述第一沉淀其余部分的至少之一用于步驟(4)的處理。利用該方法，能夠進一步提高膠原蛋白提取率并且保證膠原蛋白的生物活性。
[0013]根據本發(fā)明的一個實施例，