鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的引物探針組合物、試劑盒和多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種快速鑒別驢、馬和狐貍3種動(dòng)物源性成分的引物探針組合物、試 劑盒W及多重實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] "天上龍肉，地下驢肉"，是人們對(duì)驢肉的最高褒揚(yáng)。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)和食品學(xué)的角度看， 驢肉比牛肉、豬肉口感好、營(yíng)養(yǎng)高。驢肉中氨基酸構(gòu)成十分全面，8種人體必需氨基酸和10 種非必需氨基酸的含量都十分豐富。驢肉的不飽和脂肪酸含量，尤其是生物價(jià)值特高的亞 油酸、亞麻酸的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于豬肉和牛肉。驢肉一直被人們譽(yù)為美味保健的傳統(tǒng)食品， 然而近年來(lái)，由于養(yǎng)殖量大大減少，驢肉供應(yīng)量逐年降低，完全不能滿足火爆的市場(chǎng)需求， 價(jià)格更是不斷攀升。2014年元旦后的國(guó)際零售巨頭沃爾瑪"假驢肉口"事件并非特例，在 利益驅(qū)使下，部分餐館和不法商家為了謀權(quán)暴利，收購(gòu)問(wèn)題驢肉，采用向驢肉中滲雜廉價(jià)的 馬肉、狐貍?cè)獾炔呗云垓_消費(fèi)者，該種廉價(jià)原料經(jīng)過(guò)深加工后，已無(wú)法從外觀上對(duì)其組成進(jìn) 行鑒定。滲雜、滲假、W次充好等手段欺騙消費(fèi)者謀權(quán)暴利現(xiàn)象目前在國(guó)內(nèi)外均屢屢發(fā)生， 該種造假行為不僅僅設(shè)及經(jīng)濟(jì)、法律、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及宗教信仰問(wèn)題，部分企業(yè)在狐貍?cè)馓幚磉^(guò) 程中，甚至加入合成色素或發(fā)色劑亞硝酸鹽一亞硝酸鹽可與食物或胃中的物質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)致癌 作用，對(duì)人體健康存在極大威脅。因此，盡快建立可靠有效的驢、馬和狐貍源性檢測(cè)方法，對(duì) 于確保食品標(biāo)簽真實(shí)準(zhǔn)確，加強(qiáng)食品標(biāo)識(shí)管理，改進(jìn)食品安全，保護(hù)消費(fèi)者利益具有重要意 義。
[0003] 目前，食品中動(dòng)物源性成分鑒別的主要方法有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方 法。其中尤W分子生物學(xué)方法最為快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高效和靈敏。采用DNA分子水平的檢 測(cè)方法與蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法相比，目標(biāo)DNA比較穩(wěn)定，不易受到外界環(huán)境及加工工藝 的影響，而蛋白質(zhì)在高溫加工后構(gòu)象會(huì)改變，不穩(wěn)定，每個(gè)物種不一致，鑒別起來(lái)困難，而且 DNA提取簡(jiǎn)單，易操作。當(dāng)前，基于DNA的檢測(cè)方法中，實(shí)時(shí)巧光PCR法W其操作簡(jiǎn)便、靈敏、 特異、快速、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、閉管反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，得到研究者的普遍認(rèn)可，成為檢測(cè)的重 要工具。
[0004] 鑒于線粒體基因組（mtDNA)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、分子量小，每個(gè)細(xì)胞中有 1000-10000個(gè)拷貝，容易從組織中分離提取。大量研究證明，在動(dòng)物種屬鑒定中mtDNA與 核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、快速、降解?。庸み^(guò)程中mtDNA保持較完 整）、穩(wěn)定容易操作等優(yōu)勢(shì)。在mtDNA中，leSrRNA基因是線粒體基因組中研究較多的基因， 為生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可變序列，其序列變化與進(jìn)化距離相適 應(yīng)，被稱為進(jìn)化分子鐘?；趧?dòng)物mtDNA的PCR分子標(biāo)記技術(shù)的上述特點(diǎn)，加之多重實(shí)時(shí)巧 光PCR的快速、靈敏、高通量等特點(diǎn)，其在動(dòng)物源性成分鑒別檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005] 此外，目前針對(duì)動(dòng)物源性的巧光定量PCR檢測(cè)體系均缺乏內(nèi)標(biāo)（IAC)對(duì)反應(yīng)體系 進(jìn)行監(jiān)控，無(wú)法避免由反應(yīng)抑制因素而造成假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的引物探針組合物，該引物探 針組合物能快速鑒別驢、馬、狐貍=種動(dòng)物源性成分，特異性好，靈敏度高。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供含有上述引物探針組合物的PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒 操作方便，不易污染，準(zhǔn)確穩(wěn)定。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)方法，該方法快速方 便，能有效指示假陰性出現(xiàn)，靈敏準(zhǔn)確。
[0009] 本發(fā)明應(yīng)用PCR技術(shù)及巧光探針進(jìn)行核酸DNA分子標(biāo)記技術(shù)，采用多重多色巧光 定量PCR檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)驢、馬和狐貍3種動(dòng)物源性成份的快速、準(zhǔn)確定性檢測(cè)。引物和探 針是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的關(guān)鍵?；诰€粒體基因組具有靈敏度高、精確度好、快速、降解小（加工 過(guò)程中mtDNA保持較完整）、穩(wěn)定容易操作等優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明W線粒體leSrRNA基因?yàn)殪牖?因，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載驢、馬和狐貍的線粒體leSrRNA基因序列，應(yīng)用同源分析工 具DNAMAN軟件對(duì)其同源性比對(duì)，根據(jù)篩選出的核屯、片段兩端相似的序列，利用引物設(shè)計(jì) 軟件Primer5. 0在高度保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)同時(shí)適合驢、馬和狐貍的PCR通用引物，再使用 Primer3. 0在可變區(qū)設(shè)計(jì)驢、馬和狐貍的3種化qMan特異探針。
[0010] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的同時(shí)適合驢、馬、狐貍源性的通用引物如下： 上游引物；5'CGGGAATGACTAAATAAGACGA3' 下游引物：5'GGTCACCCCAACCGAAAT3'。 本發(fā)明設(shè)計(jì)的驢特異TaqMan探針（簡(jiǎn)稱驢特異探針，下同）為： 5'TCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAC3'。 本發(fā)明設(shè)計(jì)的馬特異化qMan探針（簡(jiǎn)稱馬特異探針，下同）為： 5'ACAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACA3'。
[0011] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的狐貍特異化qMan探針（簡(jiǎn)稱狐貍特異探針，下同）為： 5'CCCCACTGGGAATAACATACTACCATTG3' 〇
[001引在PCR檢測(cè)時(shí)，因?yàn)槎喾N因素容易出現(xiàn)PCR反應(yīng)假陰性的現(xiàn)象，為了有效指示假陰 性，本發(fā)明還設(shè)計(jì)構(gòu)建內(nèi)標(biāo)及其相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)化qMan探針（簡(jiǎn)稱內(nèi)標(biāo)探針，下同），提高檢測(cè) 的準(zhǔn)確性。內(nèi)標(biāo)的DNA序列如SEQIDN0;6 所示，為；CGGGAATGACTAAATAAGACGATGGAGCACGC CGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTCGGTTGGGGTGACC，共lOObp。 其構(gòu)建方法為：使用DNA隨機(jī)生成軟件產(chǎn)生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒(méi)有出 現(xiàn)與之同源的DNA片段，在該段隨機(jī)DNA序列上下游連接上驢、馬和狐貍3個(gè)物種的通用引 物序列，從而形成該l(K)bp的內(nèi)標(biāo)DNA序列。在PCR體系使用時(shí)，內(nèi)標(biāo)W重組質(zhì)粒的形式 加入PCR體系中，重組質(zhì)粒為內(nèi)標(biāo)的DNA序列插入質(zhì)粒PMD18-T中形成，其方法為；將該段 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列委托人工基因合成，合成片段連接到載體PMD18-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)D冊(cè)a,質(zhì)粒提 取，并測(cè)序驗(yàn)證，得到能同時(shí)針對(duì)驢、馬和狐貍3個(gè)物種檢測(cè)體系的含有內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì) 粒。
[0013]上述內(nèi)標(biāo)haMan探針為；5' -TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3'。
[0014] 本發(fā)明提供了一種能夠鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的組合物，該組合物包括上述一 對(duì)通用引物和上述驢、馬和狐貍特異化qMan探針。
[0015]進(jìn)一步的，該組合物還包括上述內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)化qMan探針。其中，所述內(nèi)標(biāo)w重組 質(zhì)粒的形式存在，所述重組質(zhì)粒為上述將內(nèi)標(biāo)的DNA序列插入質(zhì)粒PMD18-T中形成的含有 內(nèi)標(biāo)DNA的重組質(zhì)粒。
[0016]本發(fā)明中，所述驢特異探針、馬特異探針、狐貍特異探針和內(nèi)標(biāo)探針的5'端均修飾 有報(bào)告基團(tuán)，3'端均修飾有澤滅基團(tuán)。所述報(bào)告基團(tuán)可W為FAM、JOE、CY3、CY5等，所述澤 滅基團(tuán)可W為TAMRA、B冊(cè)等。
[0017]本發(fā)明還提供了一種鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中包 括；a. -對(duì)上述通用引物；b.驢、馬、狐貍3種特異化qMan探針；C.含有內(nèi)標(biāo)的重組質(zhì)粒；d 內(nèi)標(biāo)化qMan探針。所述含有內(nèi)標(biāo)的重組質(zhì)粒為內(nèi)標(biāo)DM序列與質(zhì)粒重組得到的重組質(zhì)粒。 所述質(zhì)?？蒞為PMD18-T。
[001引進(jìn)一步的，本發(fā)明試劑盒中還可W包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、Taq酶和超純水。
[0019] 上述試劑盒中，各成分的用量可W參照現(xiàn)有技術(shù)中通用的用量規(guī)則來(lái)加入，例如 各引物加入量相同，各探針加入量也相同。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)方 法，該方法包括使用本發(fā)明鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的PCR檢測(cè)試劑盒，鑒別待檢樣本中 是否含有驢、馬、狐貍源性成分的步驟。
[0021] 上述多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)方法中，使用本發(fā)明試劑盒能夠同時(shí)鑒別待檢樣 本中是否含有驢、馬、狐貍源性成分。
[0022] 上述多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)方法中，具體包括W下步驟： (1) 提取待檢樣本的基因組DNA，備用； (2) 將提取的基因組DNA加入鑒別驢、馬、狐貍動(dòng)物源性的PCR檢測(cè)試劑盒中，利用多重 實(shí)時(shí)巧光定量PCR法檢測(cè)； (3) 收集PCR擴(kuò)增過(guò)程中的巧光信號(hào)，通過(guò)巧光信號(hào)鑒別待檢樣本中是否含有驢、馬、 狐貍源性成分。
[0023] 上述方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W按照現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的方法和試劑盒提取待測(cè) 肉品的基因組DNA，該操作是容易實(shí)現(xiàn)的。
[0024] 上述方法中，所述待檢樣本可W為皮張、肉類及肉類加工品。
[002引在PCR檢測(cè)時(shí)，將試劑盒中的引物、探針、擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)等各種試劑加入一支巧光定量PCR反應(yīng)管中，然后加入模板DNA形成巧光定量PCR反應(yīng)體系。
[0026] 各種上述方法中，PCR擴(kuò)增條件為；95°ClOmin預(yù)變性；95°C5s，63°C35s，在此收 集巧光信號(hào)，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。
[0027] 上述方法中，優(yōu)先選用20y1的PCR擴(kuò)增體系。
[0028] 上述方法中，按照W下方式判讀是否含有驢、馬、狐貍源性成分： a. 當(dāng)相應(yīng)的驢、馬、狐貍特異探針的巧光信號(hào)被檢出，且Ct值<35時(shí)，無(wú)論內(nèi)標(biāo)探針的 巧光信號(hào)是否被檢出（檢測(cè)樣品會(huì)抑制內(nèi)標(biāo)DNA的擴(kuò)增），均表示待檢樣本中含有相應(yīng)的動(dòng) 物源性成分； b. 當(dāng)內(nèi)標(biāo)