修飾的apol1多肽的制作方法
【專利說明】修飾的AP0L1多化 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供了修飾的Apo-Ll蛋白。具體地，本發(fā)明提供了純化的蛋白、核酸，W及 重組表達(dá)該些修飾蛋白的方法。
[000引發(fā)明背景 蛋白在遺傳改變的原核細(xì)胞中的生物合成導(dǎo)致具有連接至氨基末端的N-甲酯-或末 端甲硫氨酸的蛋白的表達(dá)。由于向天然蛋白添加N-甲酯甲硫氨酸可改變其生物活性、構(gòu)象 穩(wěn)定性、抗原性等，在可能的情況下，最期望將其除去。
[0003] 在大腸桿菌（公.co7i)中的蛋白合成通常起始于修飾的氨基酸N-甲酯甲硫氨酸 (fMet)，因此，fMet是大多數(shù)蛋白中的N-末端氨基酸。除了極少數(shù)例外，N-甲酯基團(tuán)隨后 通過膚去甲酯酶去除，并且依賴于第二個氨基酸的身份，還通過甲硫氨酸氨膚酶（MA巧切 除N-末端甲硫氨酸。特別地，在強(qiáng)過表達(dá)的重組蛋白中，fMet去甲酯化可變得不完全，并 且由于fMet是免疫原性的，該會對用于制藥目的的蛋白造成問題。
[0004] 載脂蛋白心1 (Ap化1)是人特異性血清蛋白，其通過在寄生蟲的內(nèi)體膜中形 成離子孔殺死布氏錐蟲（化巧><3/7(95〇?<3知ucei)。布氏錐蟲羅德西亞亞種化知ucei subspeciesrAo沁siense)和岡比亞亞種（r.知化?eisubspecies腳曲如抵抗該種裂 解活性，并且能夠感染人類，導(dǎo)致昏睡癥。在布氏錐蟲羅德西亞亞種的情況下，對裂解的抗 性設(shè)及血清抗性相關(guān)（SRA)蛋白與ApoLl的C-末端螺旋的相互作用。正常的人血清（N服） 能夠殺死布氏錐蟲指名亞種（7： 知ucei)，但不能殺死布氏錐蟲羅德西亞亞種和布氏錐 蟲岡比亞亞種。
[0005] 在其分泌前導(dǎo)膚的加工后，人ApoLl具有N-末端氨基酸序列Glu-Glu-Ala-Gly-。 在大腸桿菌中過表達(dá)時，由于在第二氨基酸位置的大且?guī)щ姷墓劝彼幔珹poLl保留了在 N-末端的Met(和可能殘留的fMet)。
[0006] 為了在完全去除fMet之外還保持ApoLl的高表達(dá)率，需要將膚酶引入宿主細(xì)胞系 之外的其他技術(shù)。本發(fā)明通過提供修飾的ApoLl蛋白而滿足了該種需求，所述修飾的Ap化1 蛋白在表達(dá)時，缺少末端f-Met，同時保持高表達(dá)水平。
[0007] 附圖簡述 圖1顯示了W下的5個N-末端氨基酸的序列分析；（圖1A)Ap化1 (wt)，由pAVEOl化 表達(dá)；（圖 1B)ApoLl(A2ins)，由pAVEOl化表達(dá)；（圖 1C)ApoLl(A2ins)，由pSt油yl. 2 表達(dá)；（圖ID)ApoLl巧E2del)，ApoLl巧EA2del)，由pSt油yl. 2 表達(dá)；和（圖IE)ApoLl 巧EA2del)，由pSt油yl.2表達(dá)。通過自動化的Edman降解法鑒定氨基酸序列。對每個反應(yīng) 循環(huán)顯示確定的氨基酸數(shù)量，Wpmol表示，并且突出顯示每個循環(huán)中的優(yōu)勢氨基酸。
[0008] 圖2顯不了由內(nèi)切蛋白酶Lys-C酶切的ApoLl野生型（圖2A)、ApoLlA2ins(圖 2B)，和Ap化1EE2del(圖2C)的RP-HPLC譜圖。指出了對應(yīng)于N-末端膚片段的峰。顯示的 氨基酸序列源自于MS分析。測定的質(zhì)量對于ApoLl野生型為2502. 15Da(預(yù)期為；2502. 54 Da);對于ApoLlA2ins為 2442. 15Da(預(yù)期為；2442. 42Da);且對于ApoLl邸 2del為 2113. 03Da(預(yù)期為；2113. 13Da)(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0009] 圖3顯示了在Ap化1的存在下錐蟲的生長抑審。將布氏錐蟲細(xì)胞稀釋物與指定量 的ApoLl-起在300W的終體積中在37°C溫育20小時的時間段。隨后，使用巧光氧化還 原指示劑AlamarBlue測定錐蟲的代謝活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明部分地基于下述發(fā)現(xiàn)，即野生型ApoLl的翻譯后加工沒有完全地除去末端 或f-Met。
[0011] 本發(fā)明包括修飾的Apo-Ll多膚，其中所述多膚在重組表達(dá)時缺少N-末端甲硫氨 酸（Met)或甲酯甲硫氨酸。在某些實(shí)施方式中，所述多膚包含插入在N-末端Met和相鄰的 殘基之間的氨基酸殘基，包括插入在N-末端Met和所述相鄰的殘基之間的丙氨酸殘基。在 進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述相鄰的殘基是谷氨酸殘基。本發(fā)明提供了修飾的Apo-Ll多膚， 其包含SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 4的氨基酸序列。
[0012] 在另一個實(shí)施方式中，所述修飾的Apo-Ll多膚包含與N-末端Met相鄰的至少一 個氨基酸殘基的缺失。在可選的實(shí)施方式中，所述修飾的Apo-Ll包含與N-末端Met相鄰的 至少兩個氨基酸殘基的缺失，其中所述相鄰的殘基為谷氨酸。本發(fā)明提供了修飾的Ap化1 多膚，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。在可選的實(shí)施方式中，所述修飾的Apo-Ll包含 與N-末端Met相鄰的至少S個氨基酸殘基的缺失，其中所述相鄰的殘基為兩個谷氨酸，和 一個丙氨酸。本發(fā)明提供了修飾的Apo-Ll多膚，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在 某些實(shí)施方式中，所述修飾的ApoLl多膚由細(xì)菌細(xì)胞重組表達(dá)，所述細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿 菌細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明提供了編碼修飾的Apo-Ll多膚的分離的核酸，其包含選自SEQIDNOs: 1、 3、5和7的核酸序列。還提供了包含選自SEQIDNOs: 1、3、5和7的核酸的表達(dá)載體，和包 含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生多膚的方法，包括；在表達(dá)所述核酸序列的條件下在培 養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述修飾的Apo-Ll多膚；和從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基 回收所述修飾的Apo-Ll多膚。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，包括大 腸桿菌細(xì)胞。
[001引發(fā)明詳述 除非文中另有清楚指明，如本文，包括后附的權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式的詞語， 例如"一"（"a, " "an,"和"the,")包括其相應(yīng)的復(fù)數(shù)指代形式。
[0016] 本文中引用的所有文獻(xiàn)均通過引用并入本文，達(dá)到如具體且單獨(dú)地指出每個單獨(dú) 的出版物、專利申請或?qū)＠煌ㄟ^引用并入本文的相同程度。
[0017] I.定義。
[001引分子的"活性"可描述或是指所述分子與配體或受體的結(jié)合、催化活性、刺激基因 表達(dá)的能力、抗原活性、對其他分子的活性的調(diào)節(jié)等。分子的"活性"還可W是指在調(diào)節(jié)或 維持細(xì)胞間相互作用（例如粘附）中的活性，或維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)（例如，細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架） 中的活性。"活性"還可W指比活性，例如[催化活性]/虹g蛋白]，或[免疫活性]/虹g蛋 白]]等。
[0019]"載脂蛋白L1"或"Ap化1"是指編碼人載脂蛋白L1的基因，或者蛋白Ap化1。Ap化1 是分泌的高密度脂蛋白，其結(jié)合載脂蛋白A-I。載脂蛋白A-I是相對豐富的血漿蛋白，并且 是皿L的主要脫輔蛋白質(zhì)。
[0020]"多膚片段"是指多膚（例如，ApoLl多膚，抗ApoLl抗體或ApoLl括抗劑（例如，Ap化1-結(jié)合多膚，例如SRA)或編碼ApoLl多膚、抗ApoLl抗體、ApoLl括抗劑（例如SRA) 或反義ApoLl分子的核酸分子）的一部分，其具有與參照蛋白或核酸的一部分基本相同的 區(qū)域，并且保持所述參照蛋白或核酸的至少50%或75%，更優(yōu)選80%、90%或95%，或甚至99% 的至少一種生物活性，但不包括全長多膚或核酸分子的全部氨基酸或核酸序列。例如，相對 于全長多膚或核酸分子（例如，ApoLl多膚，抗ApoLl抗體或ApoLl括抗劑（例如SRA)或編 碼ApoLl多膚、抗ApoLl抗體、ApoLl括抗劑（例如SRA)或反義ApoLl分子的核酸分子）， 所述片段可具有少至少1個，至少5個，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個，或更 多（例如，多至200、300個或更多）的氨基酸殘基或核酸堿基。
[002。 所述"分離的"（例如，如"分離的"生物成分，例如核酸分子、蛋白、抗體或細(xì)胞，或 如"分離的"化學(xué)成分，例如化合物或其他化學(xué)治療劑）是指已經(jīng)與例如，如在所述成分天 然存在的生物的細(xì)胞中的其他生物（或化學(xué)）成分大體上分離或純化的成分。例如，如果 相對于組合物中的其他成分，所述成分在組合物中富集，從而構(gòu)成所述組合物的至少30%， 更優(yōu)選至少50%，或甚至更優(yōu)選至少75%或更多，則所述成分是"分離的"。如果相對于組合 物中的其他成分，所述成分被富集，從而構(gòu)成所述組合物的至少85%，更優(yōu)選至少90%，或甚 至更優(yōu)選至少95%、97%或99%或更多，則所述成分是"大體上分離的"或"大體上純化的"。 已"分離的"核酸和蛋白包括，例如編碼ApoLl多膚或其片段，和本發(fā)明的核酸治療劑的核 酸分子，ApoLl多膚或其片段，其每一種可W是通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法進(jìn)行純化。此術(shù)語還包括 通過在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)而制備的核酸分子和蛋白，W及化學(xué)合成的核酸分子、膚和 多膚（例如，本發(fā)明的核酸分子、蛋白和抗體的一種或多種）。
[0022] 如本文使用的，表述"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換地使用，并且所有 該些名稱均包括后代。因此，術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"包括原代對象細(xì)胞W及由其衍 生出的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)化的次數(shù)。還應(yīng)理解，由于有意或無意的突變，并非所有后代在 DM含量中都精確地相同。包括具有如用于在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行篩選的相同功能或生物 活性的突變后代。在意指不同的名稱的情況下，其由上下文將是清楚的。
[0023] 術(shù)語"控制序列"是指可操作連接的編碼序列在具體宿主生物中表達(dá)所必需的DNA 序列。適合用于原核生物的控制序列