siRNA及其在用于治療和/或預(yù)防眼部病癥的方法和組合物中的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】s i RNA及其在用于治療和/或預(yù)防眼部病癥的方法和組合 物中的應(yīng)用
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 青光眼（Glaucoma)定義為由眼內(nèi)壓（IOP)高于其正常生理界限的持續(xù)升高引起 的眼組織破壞的過(guò)程、在開角型青光眼（open angle glaucoma，OAG)中，由于視網(wǎng)膜神經(jīng) 節(jié)細(xì)胞的損失，升高的I0P引起進(jìn)行性視神經(jīng)病變（progressive optic neuropathy)，其 最終導(dǎo)致失明2。在閉角型青光眼（angle-closure glaucoma)中，IOP的突發(fā)性高度升高 使得眼睛失明。青光眼是世界上失明的第二大主要原因3,并且在世界范圍內(nèi)流行性日益增 加4。青光眼失明是由視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的變性過(guò)程引起的，但是功能上與房水（AH)分泌和 流出之間的平衡的損害有關(guān)。AH由睫狀體（CB)細(xì)胞分泌，并且流出可以通過(guò)下述兩個(gè)通路 中的一種發(fā)生：小梁網(wǎng)通路和葡萄膜鞏膜通路 5。
[0003] 當(dāng)前關(guān)于青光眼的治療不能恢復(fù)由青光眼引起的視力喪失，而是集中在降低I0P 上6。已經(jīng)表明控制I0P保護(hù)免于青光眼中對(duì)視神經(jīng)的損害 5'7。目前有五類藥物用于實(shí)現(xiàn) 降低IOP:a-腎上腺素能激動(dòng)劑，0-腎上腺素能拮抗劑，膽堿能激動(dòng)劑，前列腺素類和碳 酸酐酶抑制劑。如果使用這些藥物中的任一種沒能實(shí)現(xiàn)降低I0P的功效，可以向小梁網(wǎng)施 加激光治療以增加AH流出。最后的治療資源是手術(shù)方法，用于產(chǎn)生新的AH流出通路 8。
[0004] 目前用于與青光眼有關(guān)的I0P升高的治療具有相對(duì)少的眼科副作用，但是，如果 化合物到達(dá)血流中可能具有系統(tǒng)性副作用9a°' n。系統(tǒng)更好耐受的治療，如前列腺素類，具 有許多局部耐受問題12。這一事實(shí)連同為保持適當(dāng)?shù)腎0P水平而需要的滴注頻率使得治療 依從性成為患者的挑戰(zhàn) 13。不能遵守治療不僅能夠允許疾病進(jìn)展，而且還可能具有引起I0P 突然升高的重新啟動(dòng)作用，這可能對(duì)視神經(jīng)非常有傷害性。
[0005] 前列腺素類和e -阻斷劑是優(yōu)選的降低I0P的藥劑12'14。前列腺素類非常好地降 低I0P，并且是系統(tǒng)性安全的，但是具有一些相關(guān)的眼部副作用15,即，使虹膜顏色變深，目艮 睫毛生長(zhǎng)（lash growth)，眼周色素沉著和充血。該類藥物的較不常見的眼部副作用是眼內(nèi) 炎癥，囊樣黃斑水腫（cystoid macular edema)，和眼角膜皰瘆病毒感染的再激活16。由于 潛在的早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，前列腺素類似物在妊娠過(guò)程中是禁忌的。
[0006] e阻斷劑的典型應(yīng)用通過(guò)減少AH產(chǎn)生并且不通過(guò)增加其流出而降低I0P。典型施 用的0阻斷劑經(jīng)由結(jié)膜上皮、淚通道、鼻黏膜和胃腸道吸收到系統(tǒng)循環(huán)中，誘發(fā)系統(tǒng)性的 不利作用 17_19。在眼中，腎上腺素能受體位于流經(jīng)睫狀體和小梁網(wǎng)的血管，在此處其主要作 用是血管收縮，盡管還描述了它們參與房水分泌。之前在兔眼中的研宄表明在結(jié)膜、角膜和 睫狀突上皮中的高密度的腎上腺素能受體。在角膜內(nèi)皮、晶狀體上皮、脈絡(luò)膜和眼外肌 中也存在0 _腎上腺素能受體。在眼中檢測(cè)到的大部分0 _腎上腺素能受體屬于0 2-型 20-23 〇
[0007] RNA干擾（RNAi)是基于這樣的原理的技術(shù)：小的特別設(shè)計(jì)的化學(xué)合成的雙鏈RNA 片段可以調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中特異性信使RNA(mRNA)的降解，由此選擇性地抑制特定蛋白的合 成。這一技術(shù)已經(jīng)成為開發(fā)旨在阻斷和/或減少限定蛋白的異?；钚缘男禄衔锏姆浅Ｓ?力的工具24'25?？梢院侠淼卦O(shè)計(jì)基于RNA干擾的化合物來(lái)阻斷任意靶基因的表達(dá)，包括不能 發(fā)現(xiàn)針對(duì)其的傳統(tǒng)小分子抑制劑的基因26。RNAi成功應(yīng)用于治療的實(shí)例包括抑制人細(xì)胞中 的HIV-1復(fù)制27和敲低阿爾茨海默病動(dòng)物模型中的tau和載脂蛋白前體蛋白28。盡管RNAi 只是在十幾年前發(fā)現(xiàn)的，但是，一些化合物已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)的晚期，即，用于治療老年 性黃斑退化癥（age-related macular degeneration)的RTP801 (Quark Pharmaceuticals， Fremont，PA，II 期）和用于治療呼吸道合胞病毒的ALN-RSV01 (Alnylam Pharmaceuticals， Cambridge，MA，II期）29' 3°。由于停止治療時(shí)，必須重新合成被沉默的蛋白，從而恢復(fù)其生物 活性，因此，對(duì)于慢性病癥，RNA干擾是一種非常吸引人的方法。由此，基于RNA干擾的化合 物作用通常要比常規(guī)治療的作用更持久 24'31。
[0008] 眼睛是相對(duì)獨(dú)立的組織區(qū)室；這為基于siRNA的療法的應(yīng)用特別提供了一些優(yōu) 點(diǎn)。向眼部局部遞送化合物限制系統(tǒng)性暴露并且減少所需要的化合物的量。這允許局部沉 默某種基因并且降低眼外廣泛沉默的可能性。另外，免疫系統(tǒng)通向眼部的通路是有限的；由 此較不可能發(fā)生針對(duì)所述化合物的免疫應(yīng)答 32。
[0009] 繼續(xù)W02006/021817中所描述的工作，我們已經(jīng)開發(fā)了一種siRNA :SYL040012,顯 示為SEQ ID NO :2,其是一種化學(xué)合成的、未修飾的、19bp雙鏈寡核苷酸，在脫氧胸苷的3' 具有二核苷酸的突出端，其能夠選擇性地抑制0 2-腎上腺素能受體的合成，顯示其用于治 療患有高眼壓、開角型青光眼和其他相關(guān)疾病的患者中的升高的I0P。
[0010] 所述化合物具有已證明的抑制其靶標(biāo)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)和降低血壓正常的 兔和升高的I0P的兔模型中的I0P的功效。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述
[0012] 圖1 :SYL040012在人細(xì)胞中的體外功效。（A)人細(xì)胞中ADRB2的時(shí)間過(guò)程抑制： BxPC3和MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染100nM SYL040012或100nM混雜序列siRNA，在轉(zhuǎn)染后的不同 時(shí)間點(diǎn)提取RNA并且分析ADRB2的表達(dá)。（B)在BxPC3細(xì)胞中，響應(yīng)SYL040012的ADRB2劑 量依賴性抑制：BxPC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染增加劑量的SYL040012,并且在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分析ADRB2表 達(dá)。（C)腎上腺素能家族受體響應(yīng)SYL040012的表達(dá)。在用100nM SYL040012、混雜序列或 賦形劑（vehicle)處理的細(xì)胞中的BxPC3和MDA-MB-231。*表示相對(duì)于時(shí)間點(diǎn)0，p < 0. 5 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平。
[0013] 圖2 :SYL040012在生物學(xué)流體中的穩(wěn)定性。在兔房水和兔血清中，通過(guò)在時(shí)間0 時(shí)用在PBS中的20 yM SYL040012溶液摻加兩種生物學(xué)流體的新鮮獲得的樣品，經(jīng)由在不 同時(shí)間點(diǎn)的天然-HPLC來(lái)評(píng)估SYL040012的穩(wěn)定性。結(jié)果表示為初始量的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)表 示2次獨(dú)立的分析的平均值土S. D.。
[0014] 圖3:在用eGFP-siRNA處理后，睫狀體中的eGFP水平減少。eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠用三 個(gè)160 y g/天的劑量進(jìn)行處理。最后一次給藥后48小時(shí)，將動(dòng)物處死，摘出眼睛并進(jìn)行處 理，以用于熒光顯微鏡檢查。左圖顯示PBS處理的動(dòng)物（A)和eGFP-siRNA處理的動(dòng)物（B) 的睫狀體的Nomarski顯微照片。中間圖顯示PBS處理的動(dòng)物（C)和eGFP-siRNA處理的動(dòng) 物（D)的熒光纖維照片。右圖顯示Nomarski與熒光纖維照片的合并圖。NPE :非色素上皮； PE :色素上皮。
[0015] 圖4 :SYL040012在兔中的體內(nèi)功效。（A)SYL040012的降低I0P作用：兩組NZW兔在 連續(xù)4天的時(shí)間期間內(nèi)用SYL040012 (20nmol/天）或PBS處理。每次給藥后每?jī)尚r(shí)評(píng)估 I0P至第8小時(shí)，在第5-10天進(jìn)行相同的時(shí)間表但是不給予化合物。（B) SYL040012作用的 特異性：兩組NZW兔用lOOnM混雜的siRNA或用PBS處理。如上述評(píng)估IOP。（C) SYL040012 的長(zhǎng)期降低I0P的作用：兩組兔在兩個(gè)彼此間隔3天的無(wú)藥物時(shí)間的四天的時(shí)間期間內(nèi)給 藥20nmol/天的SYL040012或PBS。如上文所述從第1-13天評(píng)估I0P。顯示代表性的實(shí)驗(yàn)。
[0016] 圖5 :SYL040012在通過(guò)眼部水過(guò)載誘發(fā)的高眼內(nèi)壓兔模型中的功效。（A) SYL040012針對(duì)10P的劑量反應(yīng)：動(dòng)物在四天的時(shí)間期間內(nèi)以下列劑量中的一種給藥 SYL040012 :10,20,40或60nmol/只眼睛/天或PBS。最后一次劑量后120分鐘，通過(guò)眼部水 過(guò)載誘發(fā)高眼壓。在最后一次給藥的同時(shí)、眼部水過(guò)載之前60分鐘和眼部水過(guò)載前立即、 以及在眼部水過(guò)載后間隔25分鐘的總共10次測(cè)量評(píng)估I0P。數(shù)據(jù)表示為每組兩只動(dòng)物的 平均值土 s. e. m。（B) SYL040012針對(duì)I0P的特異性：如上文提及的，對(duì)動(dòng)物給藥40nmol/只 眼睛/天的SYL040012、混雜的siRNA或PBS。如A中所提及的那樣進(jìn)行眼部水過(guò)載和I0P 測(cè)量。數(shù)據(jù)表示為用于SYL040012的12只動(dòng)物；用于PBS的11只動(dòng)物和用于混雜的siRNA 的2只動(dòng)物的平均值土s. e. m。（C)在用SYL040012處理的動(dòng)物中的ADRB2水平的減小。動(dòng) 物如B中所述進(jìn)行處理，并且在最后一次I0P測(cè)量后立即將其處死，摘下眼睛，并且分離角 膜、淚腺和睫狀體。提取總RNA，并通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析ADRB2的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為每組3只 動(dòng)物的平均值土s. e. m。通過(guò)用非配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)比較每只處理的眼睛結(jié)構(gòu)與其PBS處理 的副本來(lái)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且如下所述：***P < 0. 001。
[0017] 圖6:響應(yīng)SYL040012的劑量A和B的I0P曲線。A.在12只健康的受試者中響應(yīng) 重復(fù)給藥的劑量A的SYL040012