的表達(dá)水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韓 國）將上述含有混合物的96孔板進(jìn)行以下反應(yīng)。特別地，將上述混合物在95°C條件下反應(yīng) 15分鐘，激活酶并除去cDNA的第二結(jié)構(gòu)，然后混合物進(jìn)行42個循環(huán)的反應(yīng)，每一個循環(huán)包 括變性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR綠掃描以及隨后的72°C條件下3分鐘 的延伸。接下來，混合物在55°C保持1分鐘，分析55°C -95°C的溶解曲線。PCR擴增完后，通 過計算經(jīng)GAPDH基因歸一化的mRNA值（歸一化因數(shù)，NF)來校正雙調(diào)蛋白的Ct (循環(huán)閾值） 值，然后利用未經(jīng)siRNA處理的對照值來計算ACt值。用ACt值和公式2CAet)X100(見 圖2)對因雙調(diào)蛋白特異性-siRNA引起的雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平的變化進(jìn)行相對定量。
[0358] 因此，發(fā)現(xiàn)分別具有SEQ ID NO::8,9和28的序列的有義鏈的siRNAs，在低濃 度0. 2nM時均顯示出使雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平下降50%或者更高的能力，意味著這些 siRNAs展示出抑制雙現(xiàn)蛋白的表達(dá)的高效能。
[0359] 實施例5 :目標(biāo)核苷酸序列的設(shè)計和siRNA的制各
[0360] 根據(jù)人類雙調(diào)蛋白mRNA的序列（NM_001657)，設(shè)計了可結(jié)合上siRNA的目標(biāo) 核苷酸序列（有義鏈），并制備了包含與目標(biāo)核苷酸序列互補的反義鏈的siRNA。特別 地，利用由Bioneer(韓國）開發(fā)的基因設(shè)計程序（Turbo si-Designer)根據(jù)雙調(diào)蛋白 mRNA序列（NM_001657_Verl)設(shè)計了可結(jié)合上siRNA的目標(biāo)核苷酸序列。本發(fā)明的雙 調(diào)蛋白siRNA具有一個雙鏈結(jié)構(gòu)，該雙鏈結(jié)構(gòu)包括一條由19個核苷酸組成的有義鏈和 一條與有義鏈序列互補的反義鏈。此外，制備了 siC0NT(5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3' 作為有義鏈），一種不抑制任何基因的表達(dá)的siRNA。特別地，一系列包括解阻斷，耦 聯(lián)，氧化，和加帽的過程通過利用RNA合成劑在結(jié)合了核苷酸的固體支持物上反復(fù)進(jìn)行 (384Synthesizer，BIONEER, KOREA)，從而得到包含了具有所期望長度的RNA的反應(yīng)產(chǎn)物。 利用配備了 Daisogel C18柱子（Daiso，日本）的HPLC918(日本分析工業(yè)，日本）將上述 RNA從反應(yīng)產(chǎn)物中分離純化出來，并利用MALDI-T0F質(zhì)譜儀（Shimadzu，日本）對其進(jìn)行分 析確認(rèn)它是否與期望的核苷酸序列一致。接下來，RNA的有義鏈與反義鏈互相結(jié)合，從而制 備包含了各具有SEQ ID NO:31至230的序列的有義鏈的siRNA，和siCONT。
[0361]實施例6 :siRNA對人類肺癌細(xì)朐株內(nèi)的雙調(diào)蛋白的表汰的抑制
[0362] 用分別具有SEQ ID NO: 31至230的有義鏈的各siRNA(實施例1制備的）轉(zhuǎn)化人 類肺癌細(xì)胞株（A549)，分析因siRNA的處理而造成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)，雙調(diào)蛋白的表達(dá)模式。
[0363] 6_1 :人類肺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)
[0364] 將從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)得到的人類肺癌（A549)細(xì)胞株于37°C和 5% (v/v)C02 條件下置于 RPMI-1640 培養(yǎng)基（GIBCO/Invitrogen，美國，10% (v/v)胎牛血 清，100單位/ml青霉素和1〇〇 鏈霉素）中培養(yǎng)。
[0365] 6-2 :目標(biāo)siRNA到人類肺癌細(xì)朐株的轉(zhuǎn)染
[0366] 將實施例6-1培養(yǎng)的1 X 105人類肺癌（A549)細(xì)胞置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)的DMEM中 在37°C和5% (v/v)C02條件下培養(yǎng)18小時，然后除去培養(yǎng)基，之后將500#的Opti-MEM 培養(yǎng)基分配到每一個孔內(nèi)。
[0367]同時，使3.5脂質(zhì)體Lipofectamine? RNAi Max(Invitrogen,美國）與 246.5#Opti-MEM培養(yǎng)基的混合物在室溫下反應(yīng)5分鐘，向230#Opti-MEM培養(yǎng)基內(nèi) 加入5或20#實施例5制備的含有具有任意一條SEQ ID N0:8,9和28的序列的有義鏈 的siRNA(lpm〇le/|i《)來制備最終濃度為20nM的siRNA溶液。所述脂質(zhì)體Lipofectamine max混合物和每一種siRNA溶液混合，在室溫下反應(yīng)15分鐘來制備轉(zhuǎn)染液。
[0368] 下一步，將500 上述每一種轉(zhuǎn)染液分別分配到每一個含有腫瘤細(xì)胞株和 Opti-MEM的孔內(nèi)并培育6小時，然后除去Opti-MEM培養(yǎng)基。然后將1 M￡RPMI 1640培養(yǎng) 基分配到每一個孔，并在37°C和5% (v/v)C02條件下培育24小時。
[0369]6-3:雙調(diào)蛋白mRNA的宙量分析
[0370] 以與實施例2-3-1所述的相同的方式從實施例6-2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中提取出總RNA， 并用它合成cDNA，然后用實時PCR對雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量。
[0371]6-3-1:雙調(diào)蛋白mRNA的相對宙量分析
[0372] 用從實施例6-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中以與實施例2-3-1相同的方式制備的cDNA為 模板，利用實時PCR以以下方式對雙調(diào)蛋白mRNA的相對水平進(jìn)行定量。特別地，用蒸餾 水將制備的cDNA稀釋五倍，為了分析雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平，向96孔板的每一個 孔中加入3上述稀釋過的 cDNA，10/^2XGreenStar? PCR master mix(BI0NEER， 韓國），6辦蒸餾水和1辦雙調(diào)蛋白qPCR引物（hAREG-F,ACACCTACTCTGGGAAGCGT;hAREG-R，GCCAGGTAITTGTGGITCGT;每種引物10pmole/4 , BI0NEER，韓國）來制備混合 物。同時，GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶；hGAPDH-F, GGTGAAGGTCGGAGTCAACG ;hGAPDH-R, AC CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG)，一種持家基因（后文中表示為HK基因），作為標(biāo)準(zhǔn)基因用來歸 一化雙調(diào)蛋白 mRNA 的表達(dá)水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韓國）將上述含有混合物的96孔板進(jìn)行以下反應(yīng)。特別地，將上述混合物 在95°C條件下反應(yīng)15分鐘，激活酶并除去cDNA的第二結(jié)構(gòu)，然后混合物進(jìn)行42個循環(huán)的 反應(yīng)，每一個循環(huán)包括變性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR綠掃描以及隨后 的72°C條件下3分鐘的延伸。接下來，混合物在55°C保持1分鐘，分析55°C -95°C的溶解 曲線。PCR擴增完后，通過計算經(jīng)GAPDH基因歸一化的mRNA值（歸一化因數(shù)，NF)來校正雙 調(diào)蛋白的Ct(循環(huán)閾值）值，然后利用未經(jīng)siRNA處理的對照值來計算ACt值。用ACt 值和公式2(_ AGt)X100(見圖3)對因具有SEQ ID N0:31至50各序列的有義鏈的雙調(diào)蛋白 特異性-siRNA引起的雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平的變化進(jìn)行相對定量?？梢妿缀跛械碾p 調(diào)蛋白特異性-siRNAs都抑制雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)，且與對照組相比，在經(jīng)雙調(diào)蛋白特異 性-siRNAs處理過的細(xì)胞內(nèi)，雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平下降了很多。在這些雙調(diào)蛋白特異 性-siRNAs中，包含具有SEQ ID N0:39至41，43至45,47,49和50的序列中任一條的有義 鏈的siRNA展現(xiàn)了最大的抑制雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)的能力。
[0373] 此外，發(fā)現(xiàn)一可顯示出對雙調(diào)蛋白表達(dá)的高效能抑制作用的siRNA，所述siRNA包 含具有SEQID N0:51至230各序列的有義鏈，所述siRNA類似于包含具有SEQID N0:31 至50各序列的有義鏈的siRNA。
[0374] 工業(yè)應(yīng)用性
[0375] 如上所述，本發(fā)明的雙調(diào)蛋白特異性_雙鏈寡siRNA能非常有效地抑制雙調(diào)蛋白 的表達(dá)。因此，包含以下成分的組合物能有效地用于預(yù)防或質(zhì)量呼吸道疾?。弘p調(diào)蛋白特異 性-雙鏈寡siRNA，包含了雙鏈寡siRNA的雙鏈寡結(jié)構(gòu)，和/或包含了雙鏈寡結(jié)構(gòu)的納米顆 粒。
[0376] 雖然已詳細(xì)地描述了本發(fā)明的具體特征，對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說，顯然該 描述僅是對優(yōu)選地實施方案的描述，而不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍僅受 所附權(quán)利要求及其等同物的限制。
[0377] 序列目錄Free Text
[0378] 已附上電子文檔。
【主權(quán)項】
1. 一種雙調(diào)蛋白特異性-siRNA，包含有義鏈和反義鏈，該有義鏈包含任意一條選自 SEQIDN0:1至SEQIDN0:230的序列，該反義鏈含有與上述有義鏈互補的序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的雙調(diào)蛋白特異性-siRNA，其中所述siRNA的有義鏈或反義鏈由 19-31個核苷酸組成。
3. 如權(quán)利要求1所述的雙調(diào)蛋白特異性-siRNA，其中所述有義鏈包含任一選自SEQID NO:8, 9, 28, 39至41，43至45, 47, 49和50的序列，所述反義鏈包含與上述有義鏈互補的序 列。
4. 如權(quán)利要求1至3任一項所述的雙調(diào)蛋白特異性-siRNA，其中所述siRNA的有義鏈 或反義鏈至少包含一種化學(xué)修飾。
5. 如權(quán)利要求4所述的雙調(diào)蛋白特異性-siRNA，其中所述化學(xué)修飾是選自以下修 飾中的至少一種：一個或多個核苷酸的糖結(jié)構(gòu)的2'碳位置上的0H基團(tuán)被-CH3(甲 基），-0CH3 (甲氧基），-NH2,-F(氣基），-0-2-甲氧乙基-〇-丙烷基，-0-2-甲硫基，-0-3-丙 氨基，-0-3-二甲基氨丙基，-0-N-甲基乙酰胺或-0-二甲氨基乙氧基取代的修飾；核苷酸 中的糖結(jié)構(gòu)的氧被硫取代的修飾；核苷酸與磷硫酰、硼氫化磷酸鹽或甲基膦酸酯鍵之間的 化學(xué)鍵的修飾；對PNA(核酸肽），LNA(鎖核酸）或UNA(未鎖核酸）的修飾。
6. 如權(quán)利要求1至5任一項所述的雙調(diào)蛋白特異性-siRNA，其中一個或多個磷酸基團(tuán) 結(jié)合到雙調(diào)蛋白特異性-siRNA的反義鏈的5'端。
7. -種雙鏈寡核糖核酸結(jié)構(gòu)，包含由以下結(jié)構(gòu)式（1)所代表的結(jié)構(gòu)： 結(jié)構(gòu)式（1) A-X-R-Y-B 所述結(jié)構(gòu)式（1)中A代表親水性化合物，B代表疏水性化合物，X和Y各自單獨代表簡 單的共價鍵或者連接物-介導(dǎo)的共價鍵，以及R代表所述雙調(diào)蛋白特異性-siRNA。
8. 如權(quán)利要求7所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，含有由以下結(jié)構(gòu)式（2)所代表的結(jié) 構(gòu)： 結(jié)構(gòu)式（2)
所述結(jié)構(gòu)式（2)中，S和AS分別是雙調(diào)蛋白特異性-siRNA的有義鏈和反義鏈，A，B，X和Y與權(quán)利要求7中所定義的相同。
9. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，含有由以下結(jié)構(gòu)式（3)所代表的結(jié) 構(gòu)： 結(jié)構(gòu)式（3)
所述結(jié)構(gòu)式（3)中A，B，X，Y，S和AS與權(quán)利要求8所定義的相同，5'和3'分別代表雙 調(diào)蛋白特異性-siRNA的有義鏈的5'端和3'端。
10. 如權(quán)利要求7至9任一項所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述雙調(diào)蛋白特異 性-siRNA是權(quán)利要求1至權(quán)利要求6任一項所述的siRNA。
11. 如權(quán)利要求7至10任一項所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述親水性化合物 的分子量為200-10, 000。
12. 如權(quán)利要求11所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述親水性化合物選自聚乙二 醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚惡唑啉中的任何一種。
13. 如權(quán)利要求7至10任一項所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述疏水性化合物 的分子量為250-10, 000。
14. 如權(quán)利要求13所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述疏水性化合物選自類固 醇衍生物，甘油酯衍生物，丙三醇醚，聚丙二醇，(： 12-(：15的非飽和或飽和碳?xì)湮?，二?；蚜?月旨，脂肪酸，磷脂和脂肪胺。
15. 如權(quán)利要求14所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述類固醇衍生物選自膽固 醇，膽留烷醇，膽酸，膽留醇甲酸酯，膽固醇甲酸鹽和膽固醇胺。
16. 如權(quán)利要求14所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述甘油酯衍生物選自單-甘 油酯，雙-甘油酯和三-甘油酯。
17. 如權(quán)利要求7至16任一項所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中X和Y代表的共價 鍵是可降解的鍵或者不可降解的鍵。
18. 如權(quán)利要求17所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述不可降解鍵是酰胺鍵或者 憐fe鍵。
19. 如權(quán)利要求17所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，其中所述可降解鍵是二硫鍵，可酸 解的鍵，酯鍵，酐鍵，可生物降解的鍵或可酶解的鍵。
20. 包含如權(quán)利要求7至19所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)的納米顆粒。
21. 如權(quán)利要求20所述的納米顆粒，由包含了具有不同序列的siRNAs的雙鏈寡核糖核 苷酸結(jié)構(gòu)組成。
22. -種藥物組合物，含有如權(quán)利要求1至6任一項所述的雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡 核糖核苷酸，如權(quán)利要求7至19任一項所述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，或如權(quán)利要求20或 21所述的納米顆粒，作為活性成分。
23. 如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，用于預(yù)防或治療呼吸道疾病。
24. 如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中所述呼吸道疾病選自慢性阻塞性肺疾病 (COPD)，特發(fā)性肺纖維變性（IPF)，急性/慢性支氣管炎，過敏性鼻炎，咳嗽，痰多，支氣管 炎，細(xì)支氣管炎，喉嚨痛，扁桃體炎和喉炎。
25. -種包含如權(quán)利要求22至24任一項所述的藥物組合物的凍干制劑。
26. -種預(yù)防或治療呼吸道疾病的方法，該方法包括給予任何有需要的個體如權(quán)利要 求1至6任一項所述的雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡核糖核苷酸，如權(quán)利要求7至19任一項所 述的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，如權(quán)利要求20或21所述的納米顆粒，或如權(quán)利要求22至25 任一項所述的組合物或制劑。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述呼吸道疾病是選自慢性阻塞性肺疾病 (COPD)，特發(fā)性肺纖維變性（IPF)，急性/慢性支氣管炎，過敏性鼻炎，咳嗽，痰多，支氣管 炎，細(xì)支氣管炎，喉嚨痛，扁桃體炎和喉炎。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能高效地抑制雙調(diào)蛋白的表達(dá)且能有效地用于預(yù)防或治療呼吸道疾病的雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA。此外，本發(fā)明還涉及一種雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA結(jié)構(gòu)和由所述寡siRNA結(jié)構(gòu)組成的納米顆粒，其中雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA結(jié)構(gòu)包含了通過一個簡單的共價鍵或一個由連接物-介導(dǎo)的共價鍵結(jié)合在雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA上的親水性和疏水性化合物，以便增加雙鏈寡siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)的傳送效能。本發(fā)明的雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA結(jié)構(gòu)能夠增加雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA的穩(wěn)定性，不削弱雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA的功能，同時能有效地增加雙鏈寡siRNA的細(xì)胞膜滲透性。因此，當(dāng)利用雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA結(jié)構(gòu)時，即使是在相對低的濃度下被服用的，雙調(diào)蛋白特異性-雙鏈寡siRNA仍可被有效地傳送到細(xì)胞內(nèi)，從而能有效地用于呼吸道疾病的預(yù)防或治療。
【IPC分類】C12N15-113, A61K31-7105
【公開號】CN104781403
【申請?zhí)枴緾N201380058056
【發(fā)明人】樸翰浯, 蔡濟(jì)旭, 尹坪伍
【申請人】株式會社百奧尼
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2013年10月7日
【公告號】CA2887069A1, EP2905337A1, US20150259690, WO2014054927A1