權(quán)利要求22所述的方法，其進一步包括向受試者施用包括基因的功能替代品的 核酸分子。
24. -種藥物組合物，其包括： a) 權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白；以及 b) 藥學(xué)上可接受的載體。
25. -種藥物組合物，其包括： a) 核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白；以及 b) 藥學(xué)上可接受的載體。
26. -種轉(zhuǎn)基因生物，其是通過權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白催化的重組產(chǎn)生的。
27. -種用于基因治療的方法，其包括向受試者施用包括具有由權(quán)利要求18-21中任 一項所述的方法產(chǎn)生的DNA序列的核酸分子的細胞。
28. -種用于修飾生物的基因組的方法，其包括使用權(quán)利要求18-22中任一項所述的 方法通過在核酸分子上進行位點特異性重組修飾所述生物的所述基因組。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述生物是原核生物、細菌、病毒或真核生物。
30. -種產(chǎn)生特異性結(jié)合期望的核苷酸的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE)蛋白結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的方法，其包括： a)通過使可變二殘基（RVD)內(nèi)的氨基酸殘基突變或RVD的N-末端或C-末端1至2個 氨基酸殘基內(nèi)的氨基酸殘基突變而使TALE蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列隨機化；以 及 b)選擇（a)中的隨機化的所述TALE蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述TALE蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域 特異性結(jié)合到期望的核苷酸。
31. -種分離的蛋白，其包括通過權(quán)利要求30所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因 子（TALE)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
32. 如權(quán)利要求31所述的分離的蛋白，其中所述蛋白包含1至40個TALE蛋白結(jié)合結(jié) 構(gòu)域。
33. 如權(quán)利要求32所述的分離的蛋白，其中所述蛋白特異性結(jié)合靶核苷酸序列。
34. 如權(quán)利要求33所述的分離的蛋白，其中所述蛋白包含核酸酶活性或重組酶活性。
35. 如權(quán)利要求33所述的分離的蛋白，其中所述蛋白調(diào)控基因表達。
36. -種分離的核酸分子，其編碼包含權(quán)利要求31-35中任一項所述的TALE蛋白結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的蛋白。
37. -種表達盒，其包含權(quán)利要求36所述的核酸分子。
38. -種載體，其包含權(quán)利要求37所述的表達盒。
39. -種宿主細胞，其被用權(quán)利要求37所述的核酸分子或權(quán)利要求38所述的載體轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)染。
40. -種分離的多肽，其包括黃單胞桿菌屬衍生的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE)蛋 白，所述TALE蛋白具有包括如SEQIDNO: 3 (VGKQWSGARAL)中所列的氨基酸序列的N-末端 結(jié)構(gòu)域（NTD)，所述氨基酸序列具有選自以下的一個或多個突變或缺失：Q是Y、Q是S、Q是 R、W是R、W是G、W缺失、S是R、S是H、S是A、S是N、以及S是T。
41. 如權(quán)利要求40所述的多肽，其中所述NTD包含選自以下序列的氨基酸序列： VGKYRGARAL(SEQIDN0:4)、VGKSRSGARAL(SEQIDN0:5)、VGKYHGARAL(SEQIDN0:6)* VGKRGAGARAL(SEQIDN0:7)〇
42. -種分離的多肽，其包含羅爾斯通菌屬衍生的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE)蛋 白，所述tale蛋白具有包含如seqidNo=S(Ivdiar1Qr2SOtLA)中所列的氨基酸序列的N-末 端結(jié)構(gòu)域（NTD)，所述氨基酸序列具有選自以下的一個或多個突變或缺失：1^是1(、Q是Y、Q 是S、Q是R、1?2是W、R2是G、R2缺失、S是R、S是H、S是A、S是N、以及S是T。
43. 如權(quán)利要求42所述的多肽，其中所述NTD包括選自以下序列的氨基酸序列： IVDIARQWSGDLA(SEQIDN0:9)、IVDIARYRGDLA(SEQIDN0:10)、IVDIARSRS⑶LA(SEQID N0:11)、IVDIARYHGDLA(SEQIDN0:12)和IVDIARRGAGDLA(SEQIDN0:13)。
44. 如權(quán)利要求40-43中任一項所述的多肽，其進一步包括重組酶結(jié)構(gòu)域或核酸酶結(jié) 構(gòu)域。
45. -種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求40-44中任一項所述的多肽。
46. -種表達盒，其包含權(quán)利要求45所述的核酸分子。
47. -種載體，其包含權(quán)利要求46所述的表達盒。
48. -種宿主細胞，其被用權(quán)利要求45所述的核酸分子或權(quán)利要求47所述的載體轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)染。
49. 一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE)蛋白N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD)的方法，其包 括： a) 通過使所述NTD內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基突變或缺失而使所述NTD的 氨基酸序列隨機化，其中所述氨基酸序列是SEQIDNO: 14 (VGKXXXGAR)或SEQID NO: 15 (VDIAXXXXGDLA);以及 b) 選擇（a)中的隨機化的所述TALE蛋白NTD，其中所述TALE蛋白NTD特異性結(jié)合到 期望的核苷酸或表現(xiàn)出增強的活性。
50. -種產(chǎn)生具有比對應(yīng)的野生型重組酶高的催化特異性的多個鋅指重組酶（ZFR)蛋 白的方法，其包括： a) 在重組酶催化結(jié)構(gòu)域的相當(dāng)于GinIlel20、Thrl23、Leul27、Ilel36和Glyl37或其 組合的位置進行隨機誘變，使在每個氨基酸的位置2和位置3處的所述DNA突變； b) 使a)中的所述重組酶催化結(jié)構(gòu)域與多個鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合以形成ZFR，以及 c) 富集b)中的具有比對應(yīng)的野生型重組酶高的催化特異性的ZFR。
51. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述ZFR對選自GC、GT、CA、TT和AC的DNA靶具 有增高的催化活性。
52. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述重組酶催化結(jié)構(gòu)域在Ilel36和/或Glyl37 處發(fā)生誘變。
53. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述ZFR對染色體1、染色體2、染色體4、染色體 6、染色體7、染色體11、染色體13、和/或染色體X具有增高的靶向特異性。
54. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述ZFR是在載體中。
55. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述重組酶催化結(jié)構(gòu)域是來自選自以下物質(zhì)的重 組酶： a)Tn3,也稱為EcoTn3 ;Hin，也稱為StyHin;Gin，也稱為MuGin;Sin;Beta;Pin; Min；Din；Cin；EcoTn21 ；SfaTn917 ；BmeTn5083 ；Bme53；Cpe；SauSKl；SauSK41 ；SauTn552 ； Ran；Aac；Lla；pMER05 ；Mlo92 ；M1〇90；Rrh；Pje；Req；PpsTn5501；Pae；Xan；ISXc5；Spy； RhizY4cG；SarpNLl；SsolSC1904a；SsolSC1904b；SsoISC1913 ；Aam606 ；MjaM0014；Pab； HpylS607 ；MtulS_Y349 ；MtuRv2792c；MtuRv2979c；MtuRv3828c；MtuRv0921 ；MceRv0921 ； TnpX;TndX;WwK;乳球菌噬菌體TP901-1絲氨酸重組酶；化膿性鏈球菌噬菌體(6370.I絲氨 酸重組酶；化膿性鏈球菌噬菌體4>FC1絲氨酸重組酶；李斯特菌屬噬菌體A118絲氨酸重組 酶；天藍色鏈霉菌染色體SC3C8. 24絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體SC2E1. 37絲氨酸 重組酶；天藍色鏈霉菌染色體S⑶78. 04c絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體SC8F4. 15c 絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體S⑶12A. 23絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體 SCH10. 38c絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體SCC88. 14絲氨酸重組酶；鏈霉菌噬菌體 <i>C31絲氨酸重組酶；鏈霉菌噬菌體R4絲氨酸重組酶；芽孢桿菌噬菌體巾105絲氨酸重組 酶；芽孢桿菌噬菌體SPBc2絲氨酸重組酶；芽孢桿菌前噬菌體SKIN絲氨酸重組酶；金黃色 葡萄球菌ccrA絲氨酸重組酶；金黃色葡萄球菌ccrB絲氨酸重組酶；結(jié)核分枝桿菌菌體 Bxbl絲氨酸重組酶；結(jié)核分枝桿菌前噬菌體<i>RVl絲氨酸重組酶；YBCK_ECOLI;Y4bA;Bja; Spn;Cac1956;和Cac1954;以及 b) a)的突變蛋白。
56. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述重組酶催化結(jié)構(gòu)域選自以下物質(zhì)：Gin的突變 蛋白，Hin的突變蛋白，Sin的突變蛋白，Beta的突變蛋白，Pin的突變蛋白，Min的突變蛋 白，Din的突變蛋白，Cin的突變蛋白，或Tn3的突變蛋白。
57. -種嵌合多肽，其是通過權(quán)利要求50所述的方法產(chǎn)生的。
58. 如權(quán)利要求57所述的嵌合多肽，其中所述重組酶催化結(jié)構(gòu)域是選自以下物質(zhì)： a) Tn3,也稱為 EcoTn3 ;Hin，也稱為 StyHin ;Gin，也稱為 MuGin ;Sin ;Beta ;Pin ; Min ；Din ；Cin ；EcoTn21 ；SfaTn917 ；BmeTn5083 ；Bme53 ；Cpe ；SauSKl ；SauSK41 ；SauTn552 ； Ran ；Aac ；Lla；pMER05 ；Mlo92 ；M1〇90；Rrh ；Pje ；Req ；PpsTn5501 ；Pae ；Xan ；ISXc5 ；Spy ； RhizY4cG ；SarpNLl ；SsolSC1904a ；SsolSC1904b ；SsoISC1913 ；Aam606 ；MjaM0014 ；Pab ； HpylS607 ；MtulS_Y349 ；MtuRv2792c ；MtuRv2979c ；MtuRv3828c ；MtuRv0921 ；MceRv0921 ； TnpX ;TndX ;WwK ;乳球菌噬菌體TP901-1絲氨酸重組酶；化膿性鏈球菌噬菌體(6370.1 絲氨 酸重組酶；化膿性鏈球菌噬菌體4>FC1絲氨酸重組酶；李斯特菌屬噬菌體A118絲氨酸重組 酶；天藍色鏈霉菌染色體SC3C8. 24絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體SC2E1. 37絲氨酸 重組酶；天藍色鏈霉菌染色體S⑶78. 04c絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體SC8F4. 15c 絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體S⑶12A. 23絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體 SCH10. 38c絲氨酸重組酶；天藍色鏈霉菌染色體SCC88. 14絲氨酸重組酶；鏈霉菌噬菌體 <i>C31絲氨酸重組酶；鏈霉菌噬菌體R4絲氨酸重組酶；芽孢桿菌噬菌體巾105絲氨酸重組 酶；芽孢桿菌噬菌體SPBc2絲氨酸重組酶；芽孢桿菌前噬菌體SKIN絲氨酸重組酶；金黃色 葡萄球菌ccrA絲氨酸重組酶；金黃色葡萄球菌ccrB絲氨酸重組酶；結(jié)核分枝桿菌菌體 Bxbl絲氨酸重組酶；結(jié)核分枝桿菌前噬菌體<i>RVl絲氨酸重組酶；YBCK_ECOLI ;Y4bA ;Bja ; Spn ;Cac 1956;和 Cac 1954;以及 b) a)的突變蛋白。
59. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述重組酶催化結(jié)構(gòu)域選自以下物質(zhì)：Gin的突變 蛋白，Hin的突變蛋白，Sin的突變蛋白，Beta的突變蛋白，Pin的突變蛋白，Min的突變蛋 白，Din的突變蛋白，Cin的突變蛋白，或Tn3的突變蛋白。
60. -種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求57所述的多肽。
61. -種表達盒，其包含權(quán)利要求60所述的核酸分子。
62. -種載體，其包含權(quán)利要求61所述的表達盒。
63. -種分離的宿主細胞，其含有權(quán)利要求62所述的載體。
64. -種用于位點特異性整合到DNA序列中的方法，其包括： 使所述DNA序列與權(quán)利要求57所述的嵌合多肽接觸，其中所述嵌合多肽催化位點特異 性整合。
65. -種用于基因治療的方法，其包括向受試者施用包括編碼權(quán)利要求57所述的嵌合 多肽的核酸分子的組合物，其中所述核酸分子一經(jīng)表達，存在于所述受試者的基因組中的 基因就被特異性地去除或失活。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其進一步包括向受試者施用包括基因的功能替代品的 核酸分子。
67. -種藥物組合物，其包括： a) 權(quán)利要求57所述的嵌合多肽；以及 b) 藥學(xué)上可接受的載體。
68. -種藥物組合物，其包括： a) 核酸分子，其編碼權(quán)利要求57所述的嵌合多肽；以及 b) 藥學(xué)上可接受的載體。
69. -種轉(zhuǎn)基因生物，其是通過權(quán)利要求57所述的嵌合多肽催化的重組產(chǎn)生的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了嵌合多肽，其組合物、表達載體、以及其用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞、組織、植物和動物的使用方法。本發(fā)明的組合物、載體和方法在基因治療技術(shù)中也有用。
【IPC分類】C12N15-62
【公開號】CN104781404
【申請?zhí)枴緾N201380057657
【發(fā)明人】卡洛斯·F·巴巴斯三世, 安德魯·莫瑟, 布萊恩·M·郎布, 托馬斯·甲基
【申請人】斯克利普斯研究院
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2013年9月4日
【公告號】CA2883511A1, EP2893022A2, WO2014039585A2, WO2014039585A3