5-羥甲基糠醛及其衍生物的酶氧化的制作方法
【專利說明】5-羥甲基糠醛及其衍生物的酶氧化
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年7月20日提交的美國臨時申請序列號61/673,913的優(yōu)先 權(quán)。該申請的內(nèi)容全部通過引用結(jié)合在此。
[0003] 對序列表的引用
[0004] 本申請含有一個計算機可讀形式的序列表，將該序列表通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及用于通過用半乳糖氧化酶和/或環(huán)化酶進行催化氧化來氧化5-羥甲 基糠醛（HMF)、2, 5-二甲?；秽―FF)、5-羥甲基-2-呋喃羧酸（HMFCA)、以及甲酰基呋喃 羧酸（FFCA)的工藝。
[0006] 背景
[0007] 不同工業(yè)所需的化合物多年來一直源自于石油化學工業(yè)。然而，由于原油價格的 增加以及用可再生資源代替石油化學產(chǎn)品的總體意識的存在，對于基于可再生資源生產(chǎn)化 合物一直存在一個希望并且仍然是一個希望。
[0008] 5-羥甲基糠醛（HMF ;CAS :67-47-0)是這樣一種化合物的一個實例，因為它源自 于糖的脫水，這使它可以從可再生資源中獲得。HMF可以例如被轉(zhuǎn)化為多種有用的產(chǎn)物，例 如經(jīng)銅-釕（CuRu)催化劑通過氫解C-0鍵被轉(zhuǎn)化為液體生物燃料2, 5-二甲基呋喃（羅 馬-萊西考伍（Roman-Leshkov)Y等人，自然（Nature)，2007, 447, 982)，或通過氧化被轉(zhuǎn) 化為2, 5-呋喃二羧酸（FDCA)(博伊森（B〇isen)A等人，化學工程研宄和設計（Chemical Engineering Research and Design)，2009, 87, 1318-1327)。后面的化合物 FDCA 可在聚 酯（例如聚對苯二甲酸乙二酯（PET)和聚對苯二甲酸丁二酯（PBT))的生產(chǎn)中用作對苯二 甲酸的替代。FDCA的一個缺點是，化學合成需要高壓、高溫、金屬鹽以及有機溶劑，使得該 工藝昂貴并且有污染性（庫普曼（Koopman)等人，生物資源技術(shù)（Bioresource Technolo gy)2010, 101，6291-6296)。
[0009] 2, 5-二甲?；秽―FF ;CAS :823-82-5)是HMF的一種被氧化的二醛，其可在一 系列不同的應用中用作結(jié)構(gòu)基元和交聯(lián)劑。例如，DFF可用作用于聚合物生產(chǎn)的一個單體， 例如與脲組合，或可被進一步氧化為有用的結(jié)構(gòu)基元，例如FFCA和FDCA。它還可以代替其 他常用的醛，例如用于皮革交聯(lián)的戊二醛或與脲、三聚氰胺和/或苯酚組合的用于木質(zhì)復 合材料交聯(lián)的甲醛。然而，難以通過傳統(tǒng)化學法將HMF選擇性氧化為DFF，因為該反應常不 加選擇地氧化，產(chǎn)生多種氧化產(chǎn)物的組合。
[0010] 由于升高的酶-底物特異性，通過酶催化選擇性氧化HMF可對化學法提供一個替 代方案。然而，HMF不是一種已知的天然酶底物，所以鑒別具有適合結(jié)構(gòu)的能夠選擇性氧化 HMF的酶將具有挑戰(zhàn)性。
[0011] 德烏爾澤恩（Deurzen)等人，碳水化合物化學雜志（J Carbohydrate Chemistry) 1997, 16, 299-309描述了使用氯過氧化物酶催化劑用過氧化氫將HMF氧化為 DFF。W0 2009/023174表明使用例如芳基醇氧化酶和氯過氧化物酶將HMF氧化為DFF和其 他HMF氧化產(chǎn)物。W02008/119780表明了使用真菌環(huán)化酶從吡啶產(chǎn)生N-氧化物。
[0012] 然而，由于酶特性（例如在不同條件下的穩(wěn)定性和活性）上的變異性，在本領(lǐng)域中 鑒別能夠產(chǎn)生HMF氧化產(chǎn)物（例如DFF、FFCA和FDCA)的可替代酶會是有利的。本發(fā)明尤 其提供了用于制備這類氧化產(chǎn)物的方法。
[0013] 概述
[0014] 此處描述了使用半乳糖氧化酶和/或環(huán)化酶來氧化5-羥甲基糠醛（HMF)和HMF 衍生物的酶法。
[0015] 在一個方面是一種氧化5-羥甲基糠醛（HMF)的方法，該方法包括在適合的條件下 在反應混合物中使HMF接觸一種半乳糖氧化酶，以提供2, 5-二甲?；秽―FF)。在一些 實施例中，該半乳糖氧化酶與SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在 一些實施例中，該半乳糖氧化酶是在對應于SEQ ID勵:2的位置326、329、330、以及406的 一個或多個（若干個）位置處包括取代的一個變體。在實施例中，該反應混合物進一步包括 一種環(huán)化酶，并且DFF被進一步氧化為甲酰基呋喃羧酸（FFCA)、2, 5-呋喃二羧酸（FDCA)、其 鹽、或前述各項的一種混合物。在這些實施例中的一些中，該環(huán)化酶與SEQ ID N0:9、10、ll、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或 32 中任一項的成熟 多肽序列具有至少60%序列一致性。在一些實施例中，該環(huán)化酶是在對應于SEQ ID NO: 10 的位置76、134、以及201的一個或多個（若干個）位置處包括取代的一個變體。
[0016] 在一個方面是一種氧化HMF的方法，該方法包括在適合的條件下在反應混合物中 使HMF接觸一種環(huán)化酶，以提供DFF、HMFCA、FFCA、FDCA、其鹽、或前述各項的一種混合物。 在一些實施例中，該環(huán)化酶與 SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一項的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在 一些實施例中，該環(huán)化酶是在對應于SEQ ID NO: 10的位置76、134、以及201的一個或多個 (若干個）位置處包括取代的一個變體。
[0017] 在一個方面是一種氧化DFF的方法，該方法包括在適合的條件下在反應混合物中 使DFF接觸一種環(huán)化酶，以提供FFCA、FDCA、其鹽、或前述各項的一種混合物。在一些實施例 中，該環(huán)化酶與 SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 28、29、30、31、或32中任一項的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在一些實施例中， 該環(huán)化酶是在對應于SEQ ID NO: 10的位置76、134、以及201的一個或多個（若干個）位置 處包括取代的一個變體。
[0018] 在一個方面是一種氧化5-羥甲基-2-呋喃羧酸（HMFCA)或其鹽的方法，該方法包 括在適合的條件下在反應混合物中使HMFCA或其鹽接觸一種半乳糖氧化酶，以提供FFCA或 其鹽。在一些實施例中，該半乳糖氧化酶與SEQ ID N0:2的成熟多肽序列具有至少60%序列 一致性。在一些實施例中，該半乳糖氧化酶是在對應于SEQ ID N0:2的位置326、329、330、 以及406的一個或多個（若干個）位置處包括取代的一個變體。在一些實施例中，該反應 混合物進一步包括一種環(huán)化酶。在這些實施例中的一些中，F(xiàn)FCA被進一步氧化為FDCA或 其鹽。在這些實施例中的一些中，該環(huán)化酶與SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一項的成熟多肽序列具有至少60%序 列一致性。在這些實施例中的一些中，該環(huán)化酶是在對應于SEQ ID NO: 10的位置76、134、 以及201的一個或多個（若干個）位置處包括取代的一個變體。
[0019] 在一個方面是一種氧化HMFCA或其鹽的方法，該方法包括在適合的條件下在反應 混合物中使HMFCA或其鹽接觸一種環(huán)化酶，以提供甲?；秽人酕FCA、FDCA、其鹽、或前 述各項的一種混合物。在一些實施例中，該環(huán)化酶與SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一項的成熟多肽序列具有至少 60%序列一致性。在這些實施例中的一些中，該環(huán)化酶是在對應于SEQ ID NO: 10的位置 76、134、以及201的一個或多個（若干個）位置處包括取代的一個變體。
[0020] 在一個方面是一種氧化FFCA或其鹽的方法，該方法包括在適合的條件下在反應 混合物中使FFCA或其鹽接觸一種環(huán)化酶，以提供FDCA或其鹽。在一些實施例中，該環(huán)化酶 與 SEQ ID N0:9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、 或32中任一項的成熟多肽序列具有至少60%序列一致性。在這些實施例中的一些中，該環(huán) 化酶是在對應于SEQ ID NO: 10的位置76、134、以及201的一個或多個（若干個）位置處包 括取代的一個變體。
[0021] 附圖簡要說明
[0022] 圖1顯示5-羥甲基糠醛（HMF)的氧化產(chǎn)物