品中T-2毒素的提取
[0026] 取燕麥鐮刀菌（F.avenaceum)侵染的馬鈴薯薯塊lg，用研缽研磨粉碎后移入50ml 錐形瓶中，用20%甲醇溶液（指甲醇和水按照體積比20 :80組成的混合液）作為樣品提取 液，用量為l〇ml，沖洗研缽收集樣品殘?jiān)徊⒁迫脲F形瓶中，然后用搖床充分震蕩混勻，震 蕩的轉(zhuǎn)數(shù)為50rpm，時(shí)間為3min;將錐形瓶中的液體移入到50ml離心管中，離心的轉(zhuǎn)數(shù)為 3000rpm，離心時(shí)間為3min;離心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10%甲醇溶液于4ml 離心管中，放于冰箱中2-8°C保存以供ELISA檢測(cè)。
[0027] 實(shí)施例3馬鈴薯樣品中T-2毒素的提取
[0028] 取接骨木鐮刀菌（F.sambucinum)侵染的馬鈴薯薯塊lg，用研缽研磨粉碎后移入 50ml錐形瓶中，用80%甲醇溶液（指甲醇和去離子水按照體積比80 :20組成的混合液）作 為樣品提取液，用量為30ml，沖洗研缽收集樣品殘?jiān)徊⒁迫脲F形瓶中，然后用搖床充分震 蕩混勻，震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)為200rpm，時(shí)間為IOmin;將錐形瓶中的液體移入到50ml離心管中，離 心的轉(zhuǎn)數(shù)為4500rpm，離心時(shí)間為IOmin;離心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10%甲 醇溶液于4ml離心管中，放于冰箱中2-8°C保存以供ELISA檢測(cè)。
[0029] 實(shí)驗(yàn)例1T-2毒素提取條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0030] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0031] I. 1馬鈴薯塊莖的消毒處理
[0032] 將馬鈴薯塊莖用自來水沖洗干凈，然后用70%酒精浸泡30s，然后轉(zhuǎn)入5%次氯酸 鈉溶液中浸泡5min，最后用無菌水沖洗3次，晾干備用。
[0033] 1. 2超凈工作臺(tái)的試驗(yàn)前處理
[0034] 用70 %酒精棉將操作臺(tái)的工作區(qū)域擦拭干凈，然后開啟紫外燈殺菌30min，最后 打開通風(fēng)設(shè)施，再用鑷子夾住被酒精燈點(diǎn)燃的酒精棉擦拭工作區(qū)域進(jìn)行高溫消毒，才可進(jìn) 行馬鈴薯塊莖的接菌試驗(yàn)。
[0035] I. 3薯塊接毒
[0036] 將6種鐮刀菌各保存在PDA平板上，于25°C恒溫暗室中培養(yǎng)IOd后取出備用。 將培養(yǎng)好的鐮刀菌打成Icm菌餅分別接種于馬鈴薯薯片上（將馬鈴薯用打孔器打出直徑 1-1. 5cm的圓孔，薯片厚度lcm，放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中），將6種鐮刀菌分別接種到馬鈴 薯克新13號(hào)的薯片上面，3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，最后在薯片周圍用膠頭滴管加入3ml滅菌水進(jìn)行潤 濕，封口膜密封處理，并用記號(hào)筆做好標(biāo)記，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng)10d。
[0037] 1. 4薯塊中T-2毒素提取條件優(yōu)化
[0038] 1. 4. 1樣品提取液的優(yōu)化
[0039] 分別取不同鐮刀菌侵染的薯塊lg，用研缽研磨粉碎后移入50ml錐形瓶中，用不同 濃度的甲醇溶液（溶液是指甲醇與去離子水按照體積比配制，下同）作為樣品提取液，濃度 分別為 10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 甲醇溶液，用量為 20ml， 沖洗研缽收集樣品殘?jiān)徊⒁迫脲F形瓶中，然后用搖床充分震蕩混勻，50rpm震蕩3min。將 錐形瓶中的液體移入到50ml離心管中，3000rpm離心3min，離心后取上清液500y1，再加入 2. 5ml的10%甲醇溶液于4ml離心管中，該提取液直接用于ELISA檢測(cè)，以確定最佳提取液 濃度。
[0040] 1.4. 2震蕩條件的優(yōu)化
[0041] 在樣品提取液的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別取不同鐮刀菌侵染的薯塊lg，用研缽研磨 粉碎后移入50ml錐形瓶中，用最佳濃度的甲醇溶液20ml，沖洗研缽收集樣品殘?jiān)徊⒁迫?錐形瓶中，然后用搖床充分震蕩混勻，對(duì)不同的震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)為50、 100、150、200rpm，時(shí)間設(shè)為3、5、8、IOmin進(jìn)行組合，然后3000rpm離心3min，離心后取上清 液500y1，再加入2. 5ml的10 %甲醇溶液于4ml離心管中，該提取液直接用于ELISA檢測(cè)， 以確定最佳的震蕩轉(zhuǎn)數(shù)和震蕩時(shí)間。
[0042] 1. 4. 3離心條件的優(yōu)化
[0043] 分別取不同鐮刀菌侵染的薯塊lg，用研缽研磨粉碎后移入50ml錐形瓶中，用最 佳濃度的甲醇溶液20ml，沖洗研缽收集樣品殘?jiān)徊⒁迫脲F形瓶中，然后用搖床采用最佳 震蕩轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間，充分震蕩混勻，將錐形瓶中的液體移入到50ml離心管中，采用離心的方 法進(jìn)行提取，對(duì)離心的轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，離心的轉(zhuǎn)數(shù)分別設(shè)為3000、3500、4000、 4500rpm，離心時(shí)間設(shè)為3、5、8、IOmin;離心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10%甲醇 溶液于4ml離心管中，用于ELISA檢測(cè)，以確定最佳的離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間。
[0044] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0045] 2. 1T-2毒素的樣品提取液的優(yōu)化結(jié)果
[0046] 本發(fā)明采用不同濃度的甲醇溶液對(duì)薯塊中的T-2毒素進(jìn)行提取，通過ELISA檢測(cè)， 檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0047] 結(jié)果表明，采用不同濃度的甲醇溶液進(jìn)行提取都可以檢測(cè)出T-2毒素的存在；隨 著甲醇濃度的提高，T-2毒素的提取量提高；當(dāng)采用60%的甲醇溶液提取，針對(duì)6種不同的 鐮刀菌都具有最高的提取量；繼續(xù)提高甲醇濃度，T-2毒素的提取量開始下降。
[0048] 其中，采用60%甲醇溶液提取，針對(duì)1號(hào)菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇濃度的 處理提高70. 9% ;針對(duì)2號(hào)菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇濃度的處理提高45. 4% ;針 對(duì)3號(hào)菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇濃度的處理提高146. 2%;針對(duì)4號(hào)菌，T-2毒素 的提取量比55%甲醇濃度的處理提高40% ;針對(duì)5號(hào)菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇濃 度的處理提高82. 9% ;針對(duì)6號(hào)菌，T-2毒素的提取量比其他處理提高95. 7%。因此，本發(fā) 明選擇60%甲醇溶液為樣品提取液，即甲醇和水按照體積比60 :40組成的混合液。
[0049] 表I T-2毒素的檢測(cè)結(jié)果
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：將馬鈴薯粉碎，加 入樣品提取液，震蕩，離心，取上清液，即得。
2. 按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：按照g/ml計(jì)，馬鈴薯與樣品提取液 的比例為I:10-30 ;優(yōu)選為1 :20。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：所述樣品提取液為甲醇和水按 照體積比20-80 :20-80組成的混合液；優(yōu)選為甲醇和水按照體積比50-80 :20-50組成的混 合液；最優(yōu)選為甲醇和水按照體積比60 :40組成的混合液。
4. 按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)為50-200rpm，震蕩 的時(shí)間為3-10min;優(yōu)選的，所述震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，震蕩的時(shí)間為5min。
5. 按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述離心的轉(zhuǎn)數(shù)為3000-4500rpm，離 心的時(shí)間為3-10min;優(yōu)選的，所述離心的轉(zhuǎn)數(shù)為4000rpm，離心的時(shí)間為5min。
6. 按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，還包括：向上清液中加入稀釋液進(jìn)行 稀釋，即可用于ELISA檢測(cè)。
7. 按照權(quán)利要求6所述的提取方法，其特征在于：上清液與稀釋液的體積比為1 :5 ;其 中，所述稀釋液為甲醇和水按照體積比10 :90組成的混合液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，屬于T-2毒素的檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，包括以下步驟：將馬鈴薯粉碎，加入樣品提取液，震蕩，離心，取上清液，即得。本發(fā)明通過對(duì)樣品提取液、震蕩轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間、離心轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間進(jìn)行篩選優(yōu)化，最終獲得較好的T-2毒素提取效果，使6種不同鐮刀菌感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量均達(dá)最高。本發(fā)明方法具有特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便高效等優(yōu)點(diǎn)，為相關(guān)部門的檢驗(yàn)檢疫及T-2毒素的準(zhǔn)確檢測(cè)提供了一種快捷有效的方法。
【IPC分類】C07D493-10
【公開號(hào)】CN104788468
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510154941
【發(fā)明人】李鳳蘭, 徐永清, 胡寶忠, 蔣先鋒, 馮艷忠, 付瑤, 孫美麗, 單韋鈺
【申請(qǐng)人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月2日