一種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外分離試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞高純度、高回收 率體外分離試劑盒及使用方法，采用本試劑盒分離的異體單個(gè)核細(xì)胞可用于免疫治療不明 原因習(xí)慣性流產(chǎn)。本發(fā)明所述的試劑盒包括試劑I:外周血稀釋液，試劑II:紅細(xì)胞沉淀 液，試劑III:單個(gè)核細(xì)胞分層液，試劑IV:單個(gè)核細(xì)胞洗滌液。采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行異 體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外分離可達(dá)到如下效果：①單個(gè)核細(xì)胞回收率可達(dá)到90%以上，存 活率達(dá)到98%以上，大大提高了外周血單個(gè)核細(xì)胞使用效率；②分離獲得的外周血單個(gè)核 細(xì)胞純度可達(dá)到95%以上，紅細(xì)胞和血小板殘留率小，極大地避免了由于上述組分導(dǎo)致的 過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)；③通過(guò)分離前抗凝血預(yù)離心步驟，去除血漿，與常規(guī)分離技術(shù)相比，降低了分離 試劑的使用劑量，有效降低分離成本。
【背景技術(shù)】
[0002] 所謂習(xí)慣性流產(chǎn)是指連續(xù)兩次懷孕在同一妊娠周發(fā)生自然流產(chǎn)的現(xiàn)象，40%-70% 左右的習(xí)慣性流產(chǎn)原因不明，這其中大多數(shù)疑為免疫因素所引起。免疫因素造成習(xí)慣性流 產(chǎn)的原因是：胎兒是一個(gè)既帶有母系遺傳基因又帶有父系遺傳基因的新的個(gè)體，在母體子 宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育直至分娩，胎兒與母體存在著免疫對(duì)抗和平衡。一旦母、胎雙方發(fā)生免疫不協(xié) 調(diào)，往往可引起母體對(duì)胎兒的排斥而導(dǎo)致流產(chǎn)。
[0003] 一般來(lái)說(shuō)，習(xí)慣性流產(chǎn)的女性在準(zhǔn)備再次懷孕前，需首先排除非免疫性因素，因?yàn)?內(nèi)分泌功能的異常是可用藥物調(diào)整的，而某些染色體異常引起流產(chǎn)則是目前醫(yī)學(xué)無(wú)法解決 的，而子宮形態(tài)異常、宮腔粘連等問(wèn)題更要靠手術(shù)才能解決。如果上述檢查均正常，就應(yīng)考 慮進(jìn)行免疫相關(guān)因素檢查了。隨著生殖免疫學(xué)研宄的不斷深入，人們對(duì)妊娠免疫，免疫性 習(xí)慣性流產(chǎn)的許多疑難問(wèn)題有了新的認(rèn)識(shí)，研宄發(fā)現(xiàn)封閉抗體缺乏是習(xí)慣性流產(chǎn)的主要病 因。正常孕婦的體內(nèi)都存在一種保護(hù)胎兒的抗體一封閉抗體，而80%以上的習(xí)慣性流產(chǎn)婦 女體內(nèi)測(cè)不到這種抗體，由于缺乏這種抗體，懷孕后母體對(duì)胚胎不能保護(hù)而遭排斥，導(dǎo)致流 產(chǎn)。
[0004] 異體外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫治療是從丈夫身上或第三者抽取靜脈血，然后分理提 取單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)皮下注射到妻子體內(nèi)，使妻子產(chǎn)生封閉抗體，為母體腹中的胎兒構(gòu)筑一道 安全屏障，從而最大限度地接納和保護(hù)胎兒并不被流掉。一般用異體外周血單個(gè)核細(xì)胞免 疫治療4-6次就可以產(chǎn)生抗體直至受孕生子，第1次注射后皮膚反應(yīng)重，即24-48小時(shí)局 部出現(xiàn)紅潤(rùn)硬結(jié)直徑為3-10_，伴有皮膚發(fā)癢，而幾次注射皮膚反應(yīng)逐漸減輕者妊娠預(yù)后 良好。然而現(xiàn)有技術(shù)中主要存在的問(wèn)題是分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞純度較低，紅細(xì)胞和血小 板殘留較大，導(dǎo)致輸入后的過(guò)敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增大。
[0005] 現(xiàn)有方法如申請(qǐng)?zhí)枮閆L200710062487. 6的專利公開(kāi)了一種治療習(xí)慣性流產(chǎn)的生 物學(xué)制劑，其中的技術(shù)方案為：抽取健康成年男性外周血；玻璃球脫纖維Hanks液1. 5倍稀 釋，分離單個(gè)核細(xì)胞，收集單個(gè)核細(xì)胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸、計(jì)數(shù)， 并調(diào)整細(xì)胞濃度至2X 106/ml，加入植物血凝素，37°C培養(yǎng)72h ;收集培養(yǎng)液的上清，以離心 超濾及鹿糖密度梯度離心法制備T細(xì)胞exosomes ;用無(wú)菌濾膜過(guò)濾分裝，-80°C保存即得成 品。然而，上述方法中需要37°C培養(yǎng)72h，這必然增加0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱等昂貴儀器，不利于 推廣；再就是上述方法操作繁瑣，臨床不利推廣；而且上述方案也不能有效解決提高分離 純度，減少紅細(xì)胞或血小板殘留的問(wèn)題。此外，由于細(xì)胞凍存復(fù)蘇對(duì)活性的影響，以及目前 國(guó)內(nèi)細(xì)胞凍存方法多采用DMS0、動(dòng)物血清和細(xì)胞培養(yǎng)液按不同比例搭配成的凍存液，不可 避免的存在由于外源動(dòng)物血清的引入，導(dǎo)致的動(dòng)物病原污染的可能性，這就給異體外周血 單個(gè)核細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用帶到影響，如果為了避免上述問(wèn)題，采用當(dāng)次采集，立即施 用的方法，雖然可以避免上述問(wèn)題，但由于治療時(shí)機(jī)的確定、采集時(shí)間、采集成本等問(wèn)題，在 實(shí)際操作中迫切需要提供適于體內(nèi)細(xì)胞制劑的凍存液的配比方法。
[0006] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種高純度、高回收率異體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外 分離試劑盒，用來(lái)分離單個(gè)核細(xì)胞以治療習(xí)慣性流產(chǎn)。本方法操作簡(jiǎn)單；可工業(yè)化生產(chǎn)本試 劑盒；通過(guò)血漿去除，與常規(guī)分離技術(shù)相比，本發(fā)明降低一半分離成本；通過(guò)本發(fā)明的分離 步驟，單個(gè)核細(xì)胞回收率可達(dá)到90%以上，純度可達(dá)到95%以上，存活率達(dá)到98%以上，大大 提高了外周血單個(gè)核細(xì)胞使用效率，提高了受孕率；本發(fā)明試劑盒還配制有單個(gè)核細(xì)胞凍 存試劑，該試劑的組分適于單個(gè)核細(xì)胞免疫治療并且能有效提高細(xì)胞復(fù)蘇后活性實(shí)現(xiàn)一次 采集異體外周血多次治療的目的，解決了傳統(tǒng)方法每次治療前都需采集外周血的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明具體涉及一種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞高純度、高回收率體外分離試劑盒及 使用方法，采用本試劑盒分離的異體單個(gè)核細(xì)胞可用于免疫治療不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)。
[0008] 此外，本發(fā)明通過(guò)血漿去除，與常規(guī)分離技術(shù)相比，大大降低了分離成本；通過(guò)本 發(fā)明的二次分離純化，單個(gè)核細(xì)胞回收率可達(dá)到90%以上，純度可達(dá)到95%以上，存活率達(dá) 到98%以上，大大提高了外周血單個(gè)核細(xì)胞使用效率；本發(fā)明試劑盒還配制有單個(gè)核細(xì)胞 凍存試劑，該試劑的組分適于單個(gè)核細(xì)胞免疫治療并且能有效提高細(xì)胞復(fù)蘇后活性實(shí)現(xiàn)一 次采集異體外周血多次治療的目的，解決了傳統(tǒng)方法每次治療前都需采集外周血的缺點(diǎn)。 本發(fā)明所述的異體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外分離試劑盒，包括如下試劑，試劑I :外周血稀釋 液、試劑II :紅細(xì)胞沉淀液、試劑III :單個(gè)核細(xì)胞分層液、試劑IV :單個(gè)核細(xì)胞洗滌液和試劑 V :單個(gè)核細(xì)胞凍存液，以及使用該試劑盒的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)。
[0009] 其中，所述試劑I :外周血稀釋液的組分為PBS pH 7.2,不含Ca2+和Mg2+，其中加 入1-3%人血白蛋白。
[0010] 其中，所述試劑II :紅細(xì)胞沉淀液的組分為體積百分比濃度為〇. 40-0. 65%甲基纖 維素溶液。
[0011] 優(yōu)選，所述甲基纖維素溶液的濃度為6%，此時(shí)紅細(xì)胞沉降率最高。
[0012] 其中，所述試劑III :單個(gè)核細(xì)胞分層液的組分為密度1.075-1.077±0. 001 Ficoll400與泛影葡胺混合液。
[0013] 其中，所述試劑IV :單個(gè)核細(xì)胞洗滌液的組分為PBS pH 7.2、不含Ca2+和Mg2+。
[0014] 其中，所述試劑V :單個(gè)核細(xì)胞凍存液的組分為PBS (pH 7.2、不含Ca2+和Mg 2+)， 人供體血漿、二甲基亞砜、人血白蛋白和海藻糖的組合。
[0015] 優(yōu)選，所述試劑V配制為A液和B液形式，其中A液組分為：40%PBS+60%人供體血 漿，B液組分為：80% PBS+15%DMS0+5%人血白蛋白+0. 25 mol/L海藻糖。
[0016] 利用本申請(qǐng)所述的異體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外分離試劑盒可進(jìn)行外周血單個(gè)核 細(xì)胞分離操作，其包括如下步驟：抗凝血預(yù)離心、紅細(xì)胞初反應(yīng)、紅細(xì)胞沉淀、單個(gè)核細(xì)胞分 層液兩步分離、單個(gè)核細(xì)胞二次純化、檢菌、單個(gè)核細(xì)胞凍存。
[0017] 其中，抗凝血預(yù)離心步驟為取新鮮抗凝血，加入離心管混勻后以4°C 2000-3000rpm 離心15-20分鐘，棄去上清液；本發(fā)明通過(guò)抗凝血預(yù)離心步驟，與常規(guī)分離技術(shù)相比，可降 低一半分離成本。因?yàn)檠獫{是血液的液體成份，約占全血液的50-60%，通過(guò)預(yù)離心去除血 漿，可使分離步驟中試劑II和試劑I的用量減少50-60%。
[0018] 其中，紅細(xì)胞初反應(yīng)步驟為：將步驟（1)中獲得的血細(xì)胞沉淀與試劑II按1 :1體 積比例混勻，30-37°C輕微搖晃，反應(yīng)5-10min。
[0019] 其中，紅細(xì)胞沉淀步驟為：在步驟（2)所得混合液中加入1/2體積的試劑I并混 勻，室溫自然沉降20-30分鐘。
[0020] 分離步驟①：收集步驟（3)中獲得的上清液，4