一種自體自然殺傷細(xì)胞雞尾酒式培養(yǎng)的制備方法及其試劑盒產(chǎn)品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雞尾酒式制備自體自然殺傷細(xì)胞的方法，其中包括如下特征：其 中包括如下特征：來(lái)自于癌癥患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞，在重組人白介素15、重組人 白介素18、重組人白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類(lèi)鏈相關(guān) 分子A共同作用下激活自然殺傷細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞殺傷潛能；本發(fā)明還提供 了一種含通過(guò)上述方法而得到的自體自然殺傷細(xì)胞雞尾酒式培養(yǎng)的試劑盒，可在體外大量 增殖獲得自然殺傷細(xì)胞并具有殺傷活性，可用于各類(lèi)癌癥包括實(shí)體瘤和血液腫瘤在內(nèi)的多 個(gè)療程的免疫治療。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer cells，NK)主要表達(dá)CD16+/CD56+表型，是先天 性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體抗感染免疫、抗腫瘤免疫及清除非己細(xì)胞的第一道防 線(xiàn)。與T淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞無(wú)需腫瘤特異性抗原識(shí)別便可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒 感染的細(xì)胞。NK細(xì)胞功能的發(fā)揮由其細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體所傳遞的信號(hào)共同 決定，但在癌癥患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞通過(guò)機(jī)體炎癥分子抑制NK細(xì)胞表面活化性受體表達(dá)，表 達(dá)抑制性受體從而逃避NK細(xì)胞殺傷。因而，激活NK細(xì)胞高表達(dá)活化性受體而活化其殺傷 活性就至關(guān)重要了，NK細(xì)胞對(duì)黑素瘤、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等 腫瘤治療有明顯療效。
[0003] NK細(xì)胞數(shù)量和殺傷功能與療效直接相關(guān)，治療中存在的問(wèn)題在于獲得大量NK細(xì) 胞有限和培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。傳統(tǒng)使用的白介素2激活生長(zhǎng)倍數(shù)有限，端粒長(zhǎng)度縮短，培養(yǎng)時(shí)間 過(guò)長(zhǎng)引起了 NK細(xì)胞殺傷功能低下。目前，臨床治療用的NK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也有采用基因工 程化和病毒轉(zhuǎn)染的滋養(yǎng)細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后，激活NK細(xì)胞增殖和活化其殺傷功能。
[0004] 本發(fā)明提供了 NK細(xì)胞雞尾酒式培養(yǎng)方法，即在含有重組人白介素15、重組人白介 素18、重組人白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類(lèi)鏈相關(guān)分 子A共同作用下大量擴(kuò)增NK細(xì)胞，30ml外周血來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)至21天細(xì)胞增殖到 30 X 109以上，增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，NK細(xì)胞殺瘤活性在14-16天達(dá)到最佳，培養(yǎng)過(guò)程 中不需要基因工程化的滋養(yǎng)層細(xì)胞，簡(jiǎn)單快速，為患者臨床治療大大節(jié)約了時(shí)間，并發(fā)揮出 最好的抗腫瘤作用，有助于提高臨床療效和延長(zhǎng)患者生存期，而且可以大大降低細(xì)胞培養(yǎng) 成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)能更好地從癌癥患者自體的單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增獲得NK細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)患者 體內(nèi)NK細(xì)胞免疫抑制而增強(qiáng)其殺傷活性。本發(fā)明通過(guò)前期研宄實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞尾酒式培養(yǎng)方 法，即在含有重組人白介素15、重組人白介素18、重組人白介素21、重組人白介素12、重組 人白介素7以及重組人MHC-I類(lèi)鏈相關(guān)分子A中三種以上細(xì)胞因子共同作用下誘導(dǎo)激活產(chǎn) 生NK細(xì)胞，培養(yǎng)至21天細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，所述NK細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后 ⑶56+/⑶16+表型均大于80%，⑶3+細(xì)胞低于10%，并具有很強(qiáng)殺傷活性。
[0006] NK細(xì)胞發(fā)育依賴(lài)于白介素15(Interleukin-15, IL-15)，并促使組織中休眠的NK 細(xì)胞達(dá)到效應(yīng)階段，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖和增強(qiáng)它們生物活性的功能；IL-18、 IL-21、IL-12、IL-7和MHC-I類(lèi)鏈相關(guān)分子A是與其受體結(jié)合后可以顯著誘導(dǎo)了 NK細(xì)胞的 產(chǎn)生，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的增殖、分化并能提高NK細(xì)胞殺傷活性對(duì)腫瘤完全排斥，這些細(xì)胞因子 聯(lián)合作用對(duì)活化前的NK細(xì)胞功能是有效的誘導(dǎo)劑，并協(xié)同IL-15促進(jìn)骨髓前體細(xì)胞增殖和 NK細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞毒活性，使其能殺死NK敏感的和NK抗性的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò) 發(fā)揮這些細(xì)胞因子的協(xié)同作用機(jī)制，激活NK細(xì)胞增殖和增強(qiáng)其殺傷活性，抑制NK細(xì)胞中調(diào) 節(jié)性T淋巴細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生，延長(zhǎng)NK細(xì)胞端粒酶活性，可產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞最佳的殺傷活 性。
[0007] 本發(fā)明涉及體自然殺傷細(xì)胞雞尾酒式培養(yǎng)的制備方法，其中包括如下特征：來(lái)自 于癌癥患者30ml外周血的單個(gè)核細(xì)胞，在含有重組人白介素15、重組人白介素18、重組人 白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類(lèi)鏈相關(guān)分子A中三種以 上細(xì)胞因子（優(yōu)選同時(shí)含有上述細(xì)胞因子）共同作用下激活自然殺傷細(xì)胞大量增殖，培養(yǎng) 到21天細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，并增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性。
[0008] 本發(fā)明所述的雞尾酒式培養(yǎng)體系，為細(xì)胞培養(yǎng)基中含有l(wèi)ng-500ng/ml重組人白 介素15、lng_500ng/ml重組人白介素18、lng_500ng/ml重組人白介素21、lng_500ng/ml重 組人白介素12、lng-500ng/ml重組人白介素7以及l(fā)ng-500ng/ml重組人MHC-I類(lèi)鏈相關(guān)分 子A中三種以上細(xì)胞因子。雞尾酒式培養(yǎng)體系優(yōu)選為細(xì)胞培養(yǎng)基中含有10ng-50ng/ml重組 人白介素15、10ng_50ng/ml重組人白介素18、10ng_50ng/ml重組人白介素21、10ng_50ng/ ml重組人白介素12、10ng-50ng/ml重組人白介素7以及10ng-50ng/ml重組人MHC-I類(lèi)鏈 相關(guān)分子A中三種以上細(xì)胞因子。
[0009] 本發(fā)明所述制備自體殺傷細(xì)胞雞尾酒式培養(yǎng)方法為：采集癌癥患者30ml外周血， 經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，將其在32ml的細(xì)胞培養(yǎng)基（含有5%自 體血衆(zhòng)、50ng/ml重組人白介素15、20ng/ml重組人白介素18、20ng/ml重組人白介素21、 20ng/ml重組人白介素12、20ng/ml重組人白介素7和50ng/ml重組人MHC-I類(lèi)鏈相關(guān)分子 A中三種以上細(xì)胞因子）中，加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天 以上。
[0010] 雞尾酒式激活培養(yǎng)5天后，將自然殺傷細(xì)胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充10_20mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL重組人白介素2)，在 37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；將NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)袋中，并繼續(xù)補(bǔ)充一倍 體積的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（含50-500活性單位/mL重組人白介素2)，在37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；然后自然殺傷細(xì)胞連續(xù)增殖培養(yǎng)到21天，使得細(xì)胞數(shù)達(dá)到30X 109以 上。
[0011] 所述雞尾酒式培養(yǎng)試劑，優(yōu)選地，外周血單個(gè)核細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、12孔細(xì) 胞培養(yǎng)板或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中連續(xù)培養(yǎng)5天以上，誘導(dǎo)激活NK細(xì)胞。
[0012]自然殺傷細(xì)胞優(yōu)選地，來(lái)源于癌癥患者手術(shù)一個(gè)月后、放化療一個(gè)月后采集的新 鮮外周血。NK細(xì)胞臨床治療中采取1個(gè)療程4-8次的回輸治療，即每周采集外周血1次，應(yīng) 用于1次NK細(xì)胞的回輸，共完成1個(gè)療程的4-8次的治療。
[0013] 本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基加入 50-500活性單位/mL重組人白介素2和10% (體積比）自體血清或胎牛血清，優(yōu)選地，細(xì)胞 培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，如 RPMI1640、CellGro@SCGM、Tex?MACS、K0HJIN@GT-T502、 X-VIVO和GT-H551等，含有500活性單位/mL重組人白介素2，該低濃度白介素2可促進(jìn)NK 細(xì)胞的增殖，維持NK細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng)。
[0014] 本發(fā)明還提供了雞尾酒式制備自體自然殺傷細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒包括：
[0015] (1) 200ml淋巴細(xì)胞分離液；
[00