一種雜交瘤、單克隆抗體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種雜交瘤、單克隆抗體及其用途，具體地說是涉及一種能識別黑尾葉蟬的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]黑尾葉蟬屬于同翅目，葉蟬科，是我國和亞洲其它地區(qū)的主要水稻害蟲之一。黑尾葉蟬取食和產(chǎn)卵時刺傷寄主莖葉，破壞輸導組織，受害處呈現(xiàn)棕褐色條斑，可致植株發(fā)黃或枯死，一年可發(fā)生4?7代，在福建，廣東等省冬季無滯育期。在其他地區(qū)，多以3?4齡若蟲和少數(shù)成蟲在冬季作物或雜草上過冬。成蟲多在葉鞘內(nèi)產(chǎn)卵，若蟲前期喜群集，迀移性不大，常棲息于莖干下部或葉背面。老齡若蟲轉(zhuǎn)株為害，受驚動時則迅速橫行躲避或跳落水面逃逸。成蟲趨光性強，并有趨綠習性，因而在生長旺盛，發(fā)棵嫩綠的水稻田塊里，成蟲迀入量多，危害嚴重。
[0003]本發(fā)明公開的單克隆抗體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，由于具有靈敏度高、特異性強、適于大量檢測田間黑尾葉蟬的特點，為應(yīng)用該抗體進行黑尾葉蟬的鑒定，田間黑尾葉蟬的發(fā)生動態(tài)監(jiān)測及天敵對黑尾葉蟬的捕食作用研宄奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞NC-4D12，已于2014年12月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC)(中國武漢市武漢大學)，保藏號:CCTCC No:C2014241o
[0005]一種雜交瘤，該雜交瘤為雜交瘤細胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241o
[0006]一種單克隆抗體，該抗體是由雜交瘤細胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241分泌的單克隆抗體。
[0007]作為優(yōu)選，所述雜交瘤細胞NC-4D12由下述方法制備得到:用抗原蛋白免疫BaLb/c小鼠，然后BaL b/c小鼠脾細胞與SP 2/0細胞在50%聚乙二醇作用下進行融合，融合后進行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測，篩選出陽性且不與稻田其他昆蟲和蜘蛛的抗原發(fā)生反應(yīng)的細胞株，用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株NC-4D12，即獲得單克隆抗體雜交瘤細胞；其中，所述抗原蛋白來自研磨黑尾葉蝴蟲體所得的上清液。
[0008]作為優(yōu)選，所述抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠的具體步驟為:選取10?12周齡的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐劑乳化的抗原200 μ L ;3周后免疫使用等量福氏不完全佐劑乳化抗原200 μ L ;再過3周后用不加佐劑的抗原免疫。
[0009]作為優(yōu)選，所述融合具體為:最后一次免疫后3天，收集抗血清，在無菌條件下取小鼠脾淋巴細胞用于細胞融合；采用聚乙二醇作融合劑，小鼠骨髓瘤細胞系為SP 2/0，整個過程在無菌條件下操作，將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞放入50mL離心管中，混合離心后，吸盡上清液，彈勻細胞；將離心管置于37°C水浴預(yù)溫的盛水燒杯中，在Imin內(nèi)加入50%PEG
0.1mL,靜止Imin后，逐漸加入已經(jīng)預(yù)溫至37°C的RMP1-1640培養(yǎng)基40mL，使PEG稀釋而失去作用，離心后棄上清液。
[0010]作為優(yōu)選，所述HAT培養(yǎng)具體為:將沉淀的細胞懸于40mL HAT培養(yǎng)基后，分裝于事先加有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，置于5% 0)2溫箱中在37°C下培養(yǎng)；3天后換一半HAT培養(yǎng)基，5天后再換一半HAT培養(yǎng)基，再5天改用HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0011]保藏編號CCTCC No:C2014241的雜交瘤細胞分泌得到的單克隆抗體用于識別黑尾葉蟬的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明抗體是將研磨黑尾葉蟬蟲體所得的上清液作為免疫原，利用單克隆抗體制備技術(shù)獲得的針對黑尾葉蟬特異的單克隆抗體；該抗體被用于黑尾葉蟬的鑒定、動態(tài)監(jiān)測以及研宄捕食性天敵對其的控制作用；本發(fā)明通過BaL b/c小鼠腹腔注射單克隆抗體細胞株，即可獲得大量的該單克隆抗體，與多克隆抗體相比，具有純度高，專一性強，重復(fù)性好等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0014]試驗動物:8?12周齡BaL b/c小鼠(由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)，試劑:福氏完全佐劑和不完全佐劑(購自Sigma公司)。
[0015]實施例1
一種單克隆抗體，該抗體是由雜交瘤細胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241分泌獲得，適于黑尾葉蟬樣本檢測的單克隆抗體。
[0016]雜交瘤細胞的制備，具體包括以下步驟:
(1)抗原的準備:將黑尾葉蟬供水饑餓Id后，置于-20°c冰箱中冰凍致死；取出稱重后，加入少量0.01moL/L的PBS，研磨后加入適量的PBS后離心(4500r/min，15min)，分離上清液后低溫離心(15000r/min, 1min),將上清液定容至0.05g/mL后用紫外分光光度儀測定抗原蛋白含量；將抗原液少量分裝后_80°C冰凍保存；在臨用前取少量于_20°C保存；
(2)選取10?12周齡的健康BaLb/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐劑乳化的抗原200 μ L ;3周后免疫使用等量福氏不完全佐劑乳化抗原200 μ L ;再過3周后用不加佐劑的抗原免疫；最后一次免疫后3天，收集抗血清(多克隆抗體)，在無菌條件下取小鼠脾淋巴細胞用于細胞融合；
(3)采用聚乙二醇(PEG-4000)作融合劑，小鼠骨髓瘤細胞系為SP2/0。整個過程在無菌條件下操作；將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞放入50mL離心管中，混合離心后(100r/min，2min)，吸盡上清液，以手指彈勻細胞；將離心管置于37°C水浴預(yù)溫的盛水燒杯中，在Imin內(nèi)緩慢加入細胞融合劑(50%PEG) 0.7mL ;靜止Imin后，逐漸加入已經(jīng)預(yù)溫至37°C的RMP1-1640培養(yǎng)基40mL，使PEG稀釋而失去作用；離心后(1000r/min，2min)棄上清液；將沉淀的細胞懸于40mL HAT培養(yǎng)基后，分裝于事先加有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，置于5%0)2溫箱中在37°C下培養(yǎng)；3天后換一半HAT培養(yǎng)基，5天后再換一半HAT培養(yǎng)基，再5天改用HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此時親本均已死去，如有細胞生長即為雜交瘤細胞；
(4)當小孔中細胞生長到覆蓋孔底四分之一面積時，即可吸取上清液用間接ELISA檢測抗體；選出強陽性且不與稻田其他昆蟲和蜘蛛的抗原發(fā)生反應(yīng)的細胞株，用有限稀釋法進行多次克隆化培養(yǎng)，直至所有孔均為陽性為止，獲得分泌單克隆抗體的細胞株NC-4D12，細胞株NC-4D12進一步擴大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存；
(5)取8周齡左右BaL b/c小鼠，腹腔注射0.3 mL降植烷，7?10天后腹腔注射5?10 X 15個雜交瘤細胞，注射后7?10天可見小鼠腹腔明顯膨脹，取腹水，2000r/min離心