麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨I克，pH自然，溶于0.1-1.0moI/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L。在該MYG液體再生培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
[0022]本實(shí)施例1中的PTC轉(zhuǎn)化緩沖液由終濃度為10% (w/v)的PEG4000、lmmol/L的CaCl2、lmmol/L的Tris混合而成，溶劑為純水。
[0023]本實(shí)施例1中的STC緩沖液由終濃度為0.lmol/L的山梨醇、10mmol/L Tris.Cl、10mmol/L的CaClJg合而成，溶劑為純水。
[0024]實(shí)施例2 用PDA液體培養(yǎng)基于26 °C，140rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體4天(靈芝菌種是赤芝，生物學(xué)分類名:靈芝Ganoderma lucidum (Leyss: Fr.)P.Karst，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘。接種3mL菌絲懸液到10mL MYG液體再生培養(yǎng)基中，180rpm搖床培養(yǎng)3天，然后以3000rpm離心lOmin，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗滌3次，得到新鮮的靈芝濕菌絲。
[0025]稱取2克靈芝濕菌絲，加5mL由2.5g溶壁酶溶于10mL 0.8mol/L的甘露醇溶液中而成的溶壁酶液，30°C、pH值為6.0條件下酶解2.5小時(shí)。將酶解液用滅過菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，去上清液，用0.8mol/L甘露醇洗滌I次，再用15mL STC洗滌I次，最后溶于ImL STC中。將原生質(zhì)體用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋到18個(gè)/mL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026]取160μ1靈芝原生質(zhì)體(約2X 17個(gè))，加入50μ? PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入15μ?(約15Pg)含有外源目的基因的pAN7-l真菌表達(dá)質(zhì)粒(同實(shí)施例1)和2(^L、20mmol/L ΑΤΑ,ΙΟμ?、1mmo 1/L亞精胺，充分混勻后，冰浴45分鐘。然后加入1.5mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘。4°C、8000g離心5分鐘，然后用500μ? STC重懸后于4°C、5000g離心5分鐘，再用
1.5mL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28°C放置18-24小時(shí)后，取ΙΟΟμ?涂于含有濃度為lOOPg/mL HmB的MYG固體再生培養(yǎng)基平板。15天后，轉(zhuǎn)化子長出。轉(zhuǎn)化頻率約為85個(gè)轉(zhuǎn)化子/^gDNA.17原生質(zhì)體。
[0027]本實(shí)施例2中的MYG液體再生培養(yǎng)基為:麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨I克，pH自然，溶于0.1-1.0moI/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L。在該MYG液體再生培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
[0028]本實(shí)施例2中的PTC緩沖液由終濃度為40% (w/v)的PEG4000、5mmol/L的CaCl2、5mmol/L的Tris混合而成，溶劑為純水。
[0029]本實(shí)施例2中的STC緩沖液由終濃度為0.4mol/L的山梨醇、50mmol/L Tris.Cl、50mmol/L的CaClJg合而成，溶劑為純水。
[0030]實(shí)施例3
用PDA液體培養(yǎng)基于27°C，150rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體3天(靈芝菌種是赤芝，生物學(xué)分類名:靈芝Ganoderma lucidum (Leyss: Fr.)P.Karst，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘。接種3mL菌絲懸液到10mL MYG液體再生培養(yǎng)基中，130rpm搖床培養(yǎng)4天，然后以4000rpm離心lOmin，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗滌3次，得到新鮮的靈芝濕菌絲。
[0031]稱取5克靈芝濕菌絲，加15mL由3g溶壁酶溶于10mL 0.8mol/L的葡萄糖溶液中而成的溶壁酶液，30°C、pH值為6.0條件下酶解3小時(shí)。將酶解液用滅過菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，去上清液，用0.6mol/L甘露醇洗滌I次，再用15mL STC洗滌I次，最后溶于ImL STC中。將原生質(zhì)體用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋到18個(gè)/mL，4°C保存?zhèn)溆肙
[0032]取160μ1靈芝原生質(zhì)體(約2X 17個(gè))，加入70μ? PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入50μ?(約2(^g)含有外源目的基因的ρΑΝ7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒(同實(shí)施例1)和5(^L、100mmol/L ΑΤΑ,2(^L、30mmol/L亞精胺，充分混勻后，冰浴45分鐘。然后加入2mL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘。4°C、8000g離心5分鐘，然后用500μ? STC重懸后于4°C、5000g離心5分鐘，再用2mLSTC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28°C放置18-24小時(shí)后，取ΙΟΟμ?涂于含有濃度為lOOPg/mL HmB的MYG再生固體培養(yǎng)基平板。15天后，轉(zhuǎn)化子長出。轉(zhuǎn)化頻率約為75個(gè)轉(zhuǎn)化子/^gDNA.17原生質(zhì)體。
[0033]本實(shí)施例3中的MYG液體再生培養(yǎng)基為:麥芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨I克，pH自然，溶于0.1-1.0moI/L滲透壓穩(wěn)定劑中，至總體積為1L。在該MYG液體再生培養(yǎng)基中加入15克的瓊脂，即得MYG固體再生培養(yǎng)基。
[0034]本實(shí)施例3中的PTC緩沖液由終濃度為80%(w/v)的PEG4000、10mmol/L的CaCl2、10mmol/L的Tris混合而成，溶劑為純水。
[0035]本實(shí)施例3中的STC緩沖液由終濃度為0.8mol/L的山梨醇、100mmol/L Tris.Cl、10mmoI/L的CaClJg合而成，溶劑為純水。
[0036]實(shí)施例4
對本發(fā)明利用PTC轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝真菌的方法進(jìn)行效果鑒定。從圖1至圖2可以看出，經(jīng)實(shí)施例2的方法用含有P53基因的PAN7-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化處理的靈芝原生質(zhì)體在含有l(wèi)OOPg/mL HmB的MYG再生固體培養(yǎng)基平板上生長出眾多菌株，而且這些菌株在無選擇壓力的情況下經(jīng)過5次傳代后，仍能保持良好的HmB抗性；而未經(jīng)本發(fā)明方法處理的靈芝原生質(zhì)體則全部不能在含HmB的MYG再生固體培養(yǎng)基平板上生長。說明本發(fā)明的方法已有效地將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入靈芝中，并且使該質(zhì)粒上的hph基因在靈芝中得到穩(wěn)定、高效表達(dá)。
[0037]圖3中，野生型靈芝菌株總DNA與探針之間沒有形成雜交帶，而轉(zhuǎn)化株p53-l#、P53-2#未酶切的基因組DNA樣品，在高分子量的位置與探針形成雜交帶。證明含有p53基因的外源質(zhì)粒已經(jīng)整合到這兩株靈芝的基因組DNA中。轉(zhuǎn)化株p53-l#基因組DNA用BamHI單酶切的樣品，則在約2kb和4kb處各產(chǎn)生I條雜交帶(兩條雜交帶的大小系根據(jù)圖中各電泳條帶的迀移率估算得出的)，證明可能有2個(gè)拷貝的p53基因整合到靈芝轉(zhuǎn)化株1#的基因組DNA中。
[0038]從圖4中，我們測得轉(zhuǎn)基因菌株p53-l#和p53-2#的(?63(|分別為0.363和0.469，扣除陰性對照孔(來自非轉(zhuǎn)化靈芝菌絲的總蛋白)的OD63tl值0.093后，二者的凈OD63tl值分別為0.270和0.303，根據(jù)線性回歸方程求得二者的濃度分別為8.45/ml和11.22U/ml，換算成干菌絲含量分別為16.90U/g和22.4U/g。即p53-l#、p53_2#轉(zhuǎn)基因靈芝菌株中，每克靈芝干菌絲中可表達(dá)P53蛋白16.90U和22.44U。
[0039]以上結(jié)果充分說明本發(fā)明的方法能將外源基因高效的轉(zhuǎn)化入靈芝真菌中，并使之得到穩(wěn)定的復(fù)制、傳代和表達(dá)，成功建立了靈芝的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
[0040]對比例I
用PDA液體培養(yǎng)基于28°C，180rpm培養(yǎng)從斜面接種的靈芝菌絲體3天(靈芝菌種是赤芝，生物學(xué)分類名:靈芝Ganoderma lucidum (Leyss: Fr.)P.Karst，然后用接種刀劇烈攪拌菌絲3分鐘。接種3mL菌絲懸液到10mL MYG液體再生培養(yǎng)基中，200rpm搖床培養(yǎng)3天，然后以4000rpm離心lOmin，去上清液，用0.6mol/L的硫酸鎂溶液洗滌3次，得到新鮮的靈芝濕菌絲。
[0041]稱取I克靈芝濕菌絲，加3mL由2g溶壁酶(購自廣東省微生物研宄所)溶于10mL
0.6mol/L的硫酸鎂溶液中而成的溶壁酶液，300C、pH值為6.0條件下酶解2小時(shí)。將酶解液用滅過菌的八層紗布過濾純化后，5000g離心5分鐘，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗滌I次，再用15mL STC洗滌I次，最后溶于ImL STC中。將原生質(zhì)體用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋到18個(gè)/mL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0042]取160μ1靈芝原生質(zhì)體(約2 X 17個(gè))，加入30μ? PTC轉(zhuǎn)化緩沖液，再加入20μ?(約I(^g)含有外源目的基因的ρΑΝ7-1真菌表達(dá)質(zhì)粒(同實(shí)施例1)和5(^L、10mmol/L ATA (金精三羧酸，Aurintricarboxylic acid，購自 Sigma公司，商品號 Sigma A1895),5M-L>20mmol/L亞精胺，充分混勻后，冰浴45分鐘。然后加入ImL STC緩沖液，室溫靜置25分鐘。4°C、8000g離心5分鐘，然后用500μ? STC重懸后于4°C、5000g離心5分鐘，再用ImL STC重新溶解原生質(zhì)體沉淀，26-28°C放置18-24小時(shí)后，取ΙΟΟμ?涂于含有濃度為lOOPg/mL HmB(潮霉素B，Hygromycin B)的MYG固體再生培養(yǎng)基平板。15天后，轉(zhuǎn)化子長出。轉(zhuǎn)化頻率約為33個(gè)轉(zhuǎn)化子/^g