一種用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒感染的dna核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于細(xì)胞水平和組織水平上石斑魚 虹彩病毒（SGIV)感染檢測(cè)的DNA核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 核酸適配體是由指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX)篩選得到的一類新型檢 測(cè)和治療工具。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)是一類廣受關(guān)注的新型檢測(cè)和治療的生物文 庫(kù)技術(shù)。它利用人工合成的、容量約為1〇 14~10 15的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶物質(zhì)結(jié)合，經(jīng)過(guò) 多輪篩選獲得靶物質(zhì)的核酸適配體。利用該技術(shù)篩選得到的核酸適配體具有與單克隆抗體 相當(dāng)?shù)母咛禺愋院透哂H和性，由于篩選是在體外進(jìn)行的化學(xué)過(guò)程，所以從金屬離子、有機(jī)染 料等簡(jiǎn)單體系，到病毒、細(xì)胞、組織等復(fù)雜體系，均可作為篩選對(duì)象，而且核酸適配體沒(méi)有免 疫原性，溫度變化引起的變性是可逆的，篩選時(shí)間短費(fèi)用低，得到的核酸適配體易于合成和 修飾。因此，核酸適配體不僅在新藥研發(fā)領(lǐng)域具有廣闊前景而引人矚目，其在重大疾病的生 物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研宄、疾病診斷領(lǐng)域同樣顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，石斑魚是最名貴的海水養(yǎng)殖魚類之一，具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 然而，近年來(lái)在石斑魚中暴發(fā)和流行的虹彩病毒等嚴(yán)重地威脅了石斑魚的海水養(yǎng)殖，造成 了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)際上在水產(chǎn)動(dòng)物疾病，包括石斑魚虹彩病毒快速診斷的方法主 要包括基于細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、寄生蟲學(xué)及組織病理學(xué)的傳統(tǒng)方法，基于抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方 法，針對(duì)特異性病原的抗體的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)等。這些方法各有優(yōu)點(diǎn) 同時(shí)也存在嚴(yán)重不足，所以必須著力開(kāi)發(fā)新型的、特異性更強(qiáng)、靈敏性更高、操作更簡(jiǎn)便的 核酸適配體來(lái)檢測(cè)和控制石斑魚虹彩病毒（SGIV)感染。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高特異性、高靈敏度、無(wú)免疫原性、穩(wěn)定易修飾、 便于合成和保存的用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒感染的DNA核酸適配體。
[0005] 本發(fā)明的用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒感染的DNA核酸適配體，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述的核苷酸序列上結(jié)合有用于檢測(cè)的標(biāo)記。
[0006] 上述DNA核酸適配體，其核苷酸序列上的任一位置可以被磷酸化、甲基化、氨基 化、疏化或同位素化。
[0007]所述的用于檢測(cè)的標(biāo)記優(yōu)選為：異硫氰酸熒光素（FITC)、羧基四甲基羅丹明 (TAMRA)、生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、葉酸或酶標(biāo)記。
[0008] 上述DNA核酸適配體，不論是經(jīng)部分取代或者經(jīng)過(guò)修飾后，都具有與原核酸適配 體基本相同或者類似的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能，都可用于石斑魚虹彩病毒（SGIV)檢 測(cè)。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種上述DNA核酸適配體的篩選方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0010] ⑴、合成以下隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物：
[0011] 隨機(jī)文庫(kù) Library50 :
[0012] 5? -GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
[0013] 5' 引物：5' -FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ；
[0014] 5' 引物：5' -TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ；
[0015] 3' 引物：5' -Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3'；
[0016] (2)、Cell-SELEX篩選流程：用石斑魚虹彩病毒感染正常的石斑魚脾細(xì)胞GS細(xì)胞， 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，去除培養(yǎng)基后用緩沖液洗滌被感染的GS細(xì)胞，將步驟（1)中的隨機(jī)文庫(kù) 溶解后首先與正常GS細(xì)胞在冰上孵育結(jié)合0. 5h得到上清，然后將上清與被感染的GS細(xì)胞 進(jìn)行孵育結(jié)合lh，孵育完成后去除液體并用緩沖液洗滌GS細(xì)胞，然后將洗滌后的GS細(xì)胞于 85~94°C加熱2~lOmin，離心得到上清1，將上清1與正常的GS細(xì)胞在冰上孵育結(jié)合，用 與得到上清1相同的方法得到上清2,即為被虹彩病毒感染的GS細(xì)胞的特異性核酸適配體 文庫(kù)；
[0017] (3)、文庫(kù)擴(kuò)增：利用步驟（1)中的合成的引物對(duì)步驟（2)中篩選得到的特異性核 酸適配體文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA;
[0018] (4)、DNA單鏈文庫(kù)的制備：將鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠與步驟（3)中的雙鏈DNA在 常溫下孵育，利用雙鏈DNA上的標(biāo)記與磁珠上鏈酶親和素的親和作用，將雙鏈DNA結(jié)合到磁 珠表面，在磁珠中加入堿液反應(yīng)后，回收得到上清液，將上清液通過(guò)除鹽柱收集到含有DNA 單鏈文庫(kù)的溶液；
[0019] (5)、重復(fù)多輪篩選：將步驟（4)中收集的DNA單鏈文庫(kù)代替步驟（2)中的隨機(jī)文 庫(kù)，重復(fù)以上步驟（2)-(4)至少14次，與第一輪篩選的正常細(xì)胞數(shù)目相比，將篩選過(guò)程中正 常GS細(xì)胞的數(shù)目提高2-6倍，與第一輪篩選的文庫(kù)與細(xì)胞的結(jié)合時(shí)間相比，在隨后的篩選 過(guò)程中，文庫(kù)與正常GS細(xì)胞結(jié)合時(shí)間從0. 5h增加至lh，文庫(kù)與病毒感染細(xì)胞結(jié)合時(shí)間從 lh縮短至0. 5h，以提高每輪的篩選效率，即得到用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒感染的DNA核酸 適配體。
[0020] 優(yōu)選，步驟⑵中所述的培養(yǎng)基為L(zhǎng)15培養(yǎng)基。
[0021] 優(yōu)選，步驟⑵中所述的緩沖液為PBS緩沖液。
[0022] 優(yōu)選，步驟（3)中所述的PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增體系為lOOOy1 :10Xbuffer100y1， (1階？(2.51111)80 111，模板100 111，5'引物30 111，3'引物30 111，1^&1酶10 111，（181120 650y1 ;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 °C2min，94 °Clmin，60°C30sec，72°Clmin，經(jīng)過(guò)12輪循環(huán)， 72°C5min〇
[0023] 步驟（4)中所述的回收得到上清液，優(yōu)選通過(guò)磁性分離架回收。
[0024] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒感染的試劑盒，其特征 在于，含有上述SEQ ID N0:1所示的DNA核酸適配體。
[0025] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述用于檢測(cè)石斑魚虹彩病毒感染的DNA核酸適配 體在進(jìn)行石斑魚虹彩病毒的感染檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明將隨機(jī)DNA單鏈文庫(kù)首先與正常細(xì)胞在冰上孵育后，回收到的上清1與被 病毒感染的GS細(xì)胞在冰上孵育，收集感染細(xì)胞高溫變性回收到上清2后，再次與正常細(xì)胞 冰上孵育，從而最大限度地去除與正常細(xì)胞結(jié)合的非特異單鏈DNA，實(shí)現(xiàn)提高篩選效率的目 的。
[0027] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化的細(xì)胞SELEX篩選得到 的核酸適配體，與現(xiàn)有的蛋白抗體相比具有更高的親和力和特異性，而且還具有蛋白抗體 所不具備的特點(diǎn)，包括無(wú)免疫原性；分子量小，便于體外化學(xué)合成；易于對(duì)核酸適配體的不 同部位進(jìn)行修飾和取代；序列穩(wěn)定易于運(yùn)輸和保存；制備周期短，重現(xiàn)性好；便于標(biāo)記等。 采用本發(fā)明的核酸適配體進(jìn)行石斑魚虹彩病毒的感染檢測(cè)時(shí)，操作簡(jiǎn)單迅速，可以在細(xì)胞 水平和組織水平上檢測(cè)到虹彩病毒的感染，解離常數(shù)均在納摩爾范圍以內(nèi)，并應(yīng)用于相關(guān) 的檢測(cè)試劑盒。這對(duì)于虹彩病毒感染的快速檢測(cè)具有重要意義，在虹彩病毒感染的檢測(cè)領(lǐng) 域有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】：
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中流式細(xì)胞儀檢測(cè)異硫氰酸熒光素（FITC)標(biāo)記的第9輪、10 輪、11輪、12輪、13輪、14輪篩選文庫(kù)與被虹彩病毒感染的GS細(xì)胞的結(jié)合情況，其中，A為 感染SGIV的GS靶細(xì)胞，B為正常的GS對(duì)照細(xì)胞；
[0029] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選得到的異硫氰酸熒光素（FITC)標(biāo)記 的序列1的核酸適配體與被虹彩病毒感染的GS細(xì)胞結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果；
[0030] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中羧基四甲基羅丹明（TAMRA)標(biāo)記的序列1的核酸適配體與 被虹彩病毒感染的GS細(xì)胞、正常GS細(xì)胞染色熒光強(qiáng)度差異比較（圖中的兩組圖片，左邊是 明場(chǎng)的成像，右邊是熒光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息）；
[0031] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中羧基四甲基羅丹明（TAMRA)標(biāo)記的序列1的核酸適配體與 被虹彩病毒感染的石斑魚肝臟組織、正常石斑魚肝臟組織染色熒光強(qiáng)度差異比較（圖中的 兩組圖片，左邊是明場(chǎng)的成像，右邊是熒光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息）。
【具體實(shí)施方式】：
[0032] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。以下實(shí)施例中的 實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特殊說(shuō)明，均是從常 規(guī)的生化試劑公司購(gòu)買所得到。
[0033] 實(shí)施例1 :
[0034] 1、合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物
[0035]隨機(jī)文庫(kù) Library50 :
[0036] 5 ' -GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
[0037] 5' 引物：5' -FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3'；
[0038] 5' 引物：5' -TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3' ；
[0039] 3' 引物：5' -Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3' ；
[0040]2、Cell-SELEX篩選獲得特異性識(shí)別被SGIV感染的GS細(xì)胞的核酸適配體
[0041] 2. 1L15培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清培養(yǎng)GS細(xì)胞至鋪滿培養(yǎng)瓶底95%，在培養(yǎng)瓶 中加入石斑魚虹彩病毒（SGIV)，石斑魚虹彩病毒感染正常的石斑魚脾細(xì)胞GS細(xì)胞，繼續(xù)培 養(yǎng)48h后，去除被病毒感染的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用15ml PBS洗滌被感染的GS細(xì) 胞；
[0042] 2. 2將lOnmol上述隨機(jī)文庫(kù)溶解在300 y 1 binding buffer中，95°C恒溫水浴 5min，然后迅速插入冰中，冰浴lOmin，用binding buffer補(bǔ)充至lmL，將處理后的隨機(jī)文庫(kù) 與2. 1中被SGIV感染的GS細(xì)胞在冰上孵育lh ;
[0043] 2. 3孵育結(jié)合完成后，將培養(yǎng)瓶中的液體除去，用10mL的PBS洗滌培養(yǎng)瓶中細(xì)胞； 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下并混勻在lmL PBS中，將細(xì)胞混液轉(zhuǎn)移到EP管中，94°C恒溫水浴 5min，12000g離心收集上清，即為感染SGIV的GS細(xì)胞的特異核酸適配體庫(kù)。
[0044] 3、PCR擴(kuò)增篩選文庫(kù)
[0045] 取200yl篩選得到的感染SGIV的GS細(xì)胞的特異核酸適配體庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，具體的擴(kuò)增條程序是：94°C2min，94°Clmin，60°C30s