一種制備α-1,3GT基因敲除的非人哺乳動物的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制作基因敲除動物模型的領(lǐng)域，具體講，涉及一種制備a-1，3GT基因 敲除的非人哺乳動物的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由哺乳動物細胞外基質(zhì)構(gòu)成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被廣泛 用于外科的創(chuàng)傷修復(fù)、組織重建和組織工程的支架材料等。異種器官也早已成為解決器官 移植中供器官嚴重缺乏的潛在途徑之一。然而，動物源性生物材料或異種器官組織應(yīng)用于 人體所帶來的免疫學(xué)問題直接影響著這類材料使用的安全性和有效性。異種器官移植的最 大障礙是供器官異種抗原與受者體內(nèi)天然抗體結(jié)合后激活補體系統(tǒng)，攻擊供器官而產(chǎn)生的 超急性免疫排斥反應(yīng)（Hyperacute rejection，HAR)，其發(fā)生時間在異種移植后的幾分鐘至 數(shù)小時，供器官在短時間內(nèi)發(fā)生功能衰竭使移植失敗。動物源性生物材料雖經(jīng)各種去除抗 原的處理，卻難以徹底去除所有的異種抗原，殘留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反應(yīng)和免 疫毒性而影響創(chuàng)傷愈合的重要因素。
[0003] 已有研宄顯示異種抗原a -半乳糖基抗原（a-1，3-galactosyle，a-Gal)是動 物源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應(yīng)中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚 乳糖胺核心末端殘基的細胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，廣泛存在于豬和其它低等動物體 內(nèi)。a -Gal 主要受 a -1，3 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（a 1，3-galactosyltransferase, a -1，3GT 或 GGTA1)及異紅細胞糖苷醋合成酶（isoglobotriosylceramide synthase 或 isogloboside 3synthaSe，iGb3S)調(diào)控。由于人體及類人猿、舊世紀猴的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因有2個堿基 錯位變異而不表達Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗a -Gal抗體（占總血清球蛋白的 1% )，因此當(dāng)人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時會導(dǎo)致超急性免疫排斥 反應(yīng)及慢性的免疫毒性反應(yīng)。有研宄證實人血清中的抗a-Gal抗體既與a-1，3GT催化的 Gal抗原（糖蛋白）反應(yīng)，也與iGb3S催化的Gal抗原（糖脂肪）反應(yīng)。動物源性生物材料 或異種器官移植中Gal抗原的去除成為降低免疫排斥和慢性免疫毒性反應(yīng)的關(guān)鍵。目前， 如何評價Gal抗原的去除和殘留Gal抗原誘導(dǎo)的免疫毒性尚存在著瓶頸。由于野生型低等 動物都表達a -Gal抗原，因此無法利用野生型低等動物去評價a -Gal抗原相關(guān)的免疫毒 性反應(yīng)，只能用狒狒作為受體來考察a -Gal抗原陽性或者異體器官的免疫毒性反應(yīng)，而這 種動物稀少很難普及使用。因此，如何評價動物源性生物材料或異種器官組織的免疫毒性 存在著瓶頸。檢測與監(jiān)管機構(gòu)因沒有方法和標準可依據(jù)而無法進行有效的安全性和質(zhì)量監(jiān) 控，同時也限制了該類產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
[0004] 國際上早在90年代就有通過構(gòu)建a -1，3GT基因敲除小鼠，來研宄a -Gal相關(guān)的 免疫學(xué)反應(yīng)，探討不含Gal抗原的克隆動物的構(gòu)建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle 等報告了 a-l，3GT基因敲除小鼠模型的成功制作方法，為a_l，3GT基因敲除克隆豬的 構(gòu)建開辟了先鋒。之后開始有報告使用a-1，3GT基因敲除小鼠模型研宄其與人所誘導(dǎo)抗 體的相似性及其免疫學(xué)特征。Chiang TR等報告，a-l，3GT基因敲出小鼠免疫后誘導(dǎo)的 抗-Gal抗體與a -Gal結(jié)合的親和性和人的抗Gal抗體相似，是能夠誘導(dǎo)Gal抗原陽性異 種心臟補片的超急性免疫排斥反應(yīng)。Chong A等報告，a_l，3GT基因敲除小鼠能夠誘導(dǎo)自 然的抗a -Gal IgM和IgG，并呈現(xiàn)周齡依存性增強；在同種異體或異種補片移植后可以觀 察到T-cell依存性的抗a -Gal抗體反應(yīng)。這些研宄提示a -1，3GT基因敲除小鼠模型對 Gal抗原殘留誘導(dǎo)的免疫毒性具有敏感的反應(yīng)性。
[0005] a -Gal抗原引起的超急性免疫排斥反應(yīng)和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入 研宄。許多實驗室采用了不同的方法對供器官或細胞進行處理，其中以酶處理法、物理化學(xué) 分離法及交聯(lián)法和基因改造等方法的研宄最廣泛。在2000年初研宄者們開始了 a-1，3GT 基因敲除豬的研宄，甚至a-1，3GT基因敲除牛的研宄，期望能夠直接從a-1，3GT基因敲除 豬或牛獲得沒有Gal抗原的組織或器官，以避免動物源性生物材料及異種臟器移植的免疫 排斥反應(yīng)。Dai Y及Lai L等報道，他們運用核轉(zhuǎn)移技術(shù)成功培育出了 a_l，3GT基因敲除 豬（GT/KO pig)。實驗研宄顯示a _1，3GT基因敲除豬來源的生物材料能夠顯著減輕Gal抗 原誘導(dǎo)的超急性排斥反應(yīng)。
[0006] 國內(nèi)關(guān)于a-1，3GT基因敲除動物模型的研宄也已起步，但進展緩慢，大部分研宄 都還停留在打靶載體構(gòu)建或胚胎細胞重組的階段。關(guān)于iGb3S基因敲除動物的研宄未見報 道。第三軍醫(yī)大學(xué)的張偉在博士論文中曾記述了 C57BL/6J小鼠胚胎干細胞的a-l，3GT基 因敲除的工作，成功獲得了 a-1，3GT基因敲除的小鼠胚胎干細胞。作者周建在林愛星導(dǎo)師 的指導(dǎo)下曾進行了"豬體細胞a-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的敲除并敲入HLA-G1基因的 研宄"，獲得敲除a-1，3GT并敲入HLA-G1基因的體細胞。在2011年，南方醫(yī)科大學(xué)的鄭道 山碩士研宄生開展了 "利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1 ( a -1，3GT)基 因"的研宄。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研宄所的作者常宏宇報道了利用正負篩選打靶載體 在豬腎細胞系PK-15細胞中敲除GGTA1基因，獲得了雜合子GGTA1 (+/-)PK-15細胞。戴一 凡教授早在2002年在美國留學(xué)期間就在國際上率先發(fā)表了 a _1，3GT基因敲除豬的研宄成 果。據(jù)報道戴一凡教授于2011年回到南京醫(yī)科大學(xué)代謝疾病研宄中心，率領(lǐng)團隊開始了 a-1，3GT基因敲除豬的深入研宄和育種繁殖，并很快成功迎來了首批轉(zhuǎn)基因克隆豬的誕 生。
[0007] 有研宄發(fā)現(xiàn)，a _1，3GT基因敲除的小鼠或者豬仍然表達a-Gal抗原，仍然能夠 觀察到輕度的免疫排斥反應(yīng)。另外有研宄已經(jīng)證實人的組織器官中不表達活性的iGb3， 提示由iGb3S轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)寫的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是動物源性材料移植于人 體時造成異種免疫排斥反應(yīng)的另一種外源性抗原。Milland等的研宄顯示在a-l，3GT基 因敲除動物體內(nèi)仍然表達低水平但有顯著意義的Gal抗原。a -1，3GT基因敲除小鼠表達 iGb3S mRNA，更重要的是a-l，3GT基因敲除小鼠來源的抗體與iGb3S合成的脂肪骨架的 Gal a (1，3) Gal抗原反應(yīng)。這一研宄結(jié)果提示iGb3S合成的Gal a (1，3) Gal糖脂肪抗原可 能是造成異體移植慢性免疫排斥反應(yīng)的主要原因。因此，Milland等認為a -1，3GT基因敲 除動物雖然避免了急性免疫排斥反應(yīng)，脂肪連接的Gal抗原是異體移植后期慢性免疫排斥 反應(yīng)的根源。有學(xué)者開始研宄iGb3介導(dǎo)的免疫反應(yīng)以及iGb3S缺損模型動物的免疫學(xué)變 化。
[0008] 然而，上述的一些研宄也只限于個人的實驗室研宄范圍，國內(nèi)還沒有具有自主知 識產(chǎn)權(quán)的a-1，3GT基因敲除小鼠。而由于國際間技術(shù)壁皇的存在，在國內(nèi)無法得到相關(guān)的 模型動物。針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種制備a -1，3GT基因敲除的非人哺乳動物 的方法。
[0010] 本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該a-1，3GT基因敲除的非人哺乳動物的應(yīng)用。
[0011] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為：
[0012] 一種制備a -1，3GT基因敲除的非人哺乳動物的方法，包括以下步驟：
[0013] (1)構(gòu)建打靶載體：從C57BL/6J小鼠基因組DNA中分離a -1，3GT(GGTA1)基因， 經(jīng)長鏈PCR方法擴增獲得同源臂，與抗生素耐藥基因復(fù)合構(gòu)建打靶載體；
[0014] (2)將打靶載體轉(zhuǎn)入到胚胎細胞，將重組胚胎細胞注入代孕動物胚胎中，移植到假 孕動物體內(nèi)，與正常動物交配；
[0015] (3)對得到的嵌合體動物進行基因型驗證，篩選基因成功敲除的陽性基因敲除的 嵌合體動物；進一步與野生型動物交配，獲得F1代雜合子；F1代雜合子之間交配后獲得兩 條染色體均被剔出的純合子動物，建系獲得基因敲除動物種群。其制備方法的流程圖如附 圖16所示。
[0016] 本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為：所述的非人哺乳動物為小鼠，進一步優(yōu)選C57BL 小鼠。
[0017] 本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為：所述的a-l，3GT基因敲除為敲除a-l，3GT基因 的功能性催化