用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的引物、試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的引物、試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Real-time PCR是一項(xiàng)目前廣泛應(yīng)用于科研、臨檢的DNA擴(kuò)增技術(shù)，它將微量的DNA或RNA模板數(shù)量放大百萬(wàn)倍以上，以形象的邏輯斯蒂曲線將產(chǎn)物的變化過(guò)程描繪出來(lái)，以便人們觀測(cè)基因的有或無(wú)，多與少，正?；蛘甙l(fā)生變異(突變、重復(fù)、缺失、易位等)。在Real-time PCR中，最為可靠也是最常用的是Taqman探針技術(shù)。它和普通PCR技術(shù)相比，Real-time PCR具有以下優(yōu)勢(shì)特征:(I)熒光探針和模板的雜交過(guò)程在密閉反應(yīng)管中進(jìn)行，不會(huì)造成普通PCR的氣溶膠污染；(2)實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程，對(duì)異常情況(如信號(hào)突增)有更好的判斷；(3)采用熒光探針技術(shù)，不僅量化準(zhǔn)確，而且保證了整個(gè)反應(yīng)的敏感和特異性。
[0003]然而，對(duì)于僅發(fā)生一個(gè)堿基突變的靶序列，檢測(cè)十分困難。目前運(yùn)用的方法主要有限制性?xún)?nèi)切酶片段切割法，ARMS法，MGB探針?lè)?、芯片雜交法等。這些方法主要應(yīng)用于科研，操作較為繁雜冗長(zhǎng)，結(jié)果穩(wěn)定性差，不易判讀，在臨床應(yīng)用上受到諸多限制。后來(lái)，研究人員在ARMS法的基礎(chǔ)上,結(jié)合突光定量PCR技術(shù),發(fā)展出TaqMAMA方法(Taqman mismatchamplificat1n mutat1n assay),該技術(shù)對(duì)模板和弓I物的匹配度做了改進(jìn)，使得擴(kuò)增特異性大幅增加，有效獲得單堿基突變的識(shí)別效果。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一些類(lèi)似技術(shù)較好解決了之前操作復(fù)雜，穩(wěn)定性差的問(wèn)題，但依然存在以下缺陷:(1)不能直接用于全血、尿液、組織液、植物粗提液等樣本類(lèi)型的擴(kuò)增；(2)對(duì)野生型、突變型及雜合型的區(qū)分度不夠高；(3)對(duì)樣本的新鮮程度、樣本量有較為苛刻的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ):
[0005]“Ct值”是指使用熒光定量PCR方法檢測(cè)DNA時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)。由于是兩管反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，所以Ct值分別以CtA和CtB表示。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的引物。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的引物，針對(duì)基因突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)野生型正向引物和突變型正向引物，或者設(shè)計(jì)野生型反向引物和突變型反向引物，在每組所述野生型和突變型正向引物的3’端倒數(shù)第三個(gè)堿基引入一個(gè)突變點(diǎn)，或者在每組所述野生型和突變型反向引物的3’端倒數(shù)第三個(gè)堿基引入一個(gè)突變點(diǎn)，增加引物和模板的不匹配度；每組所述野生型和突變型正向引物的3’端最后一個(gè)堿基不同，或者每組所述野生型和突變型反向引物的3’端最后一個(gè)堿基不同。
[0008]優(yōu)選的，所述每組所述野生型和突變型正向引物的3’端倒數(shù)第三個(gè)堿基相同，或者每組所述野生型和突變型反向引物的3’端倒數(shù)第三個(gè)堿基相同。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒含有上述引物。
[0010]優(yōu)選的，該試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、正向弓丨物或反向引物和Taqman探針。
[0011]優(yōu)選的，根據(jù)野生型正向引物和突變型正向引物設(shè)計(jì)反向引物，或者根據(jù)野生型反向引物和突變型反向引物設(shè)計(jì)正向引物。
[0012]優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為耐高溫及熱啟動(dòng)的酶，可常溫儲(chǔ)存。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的試劑盒的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括以下步驟，
[0014]I)直接將樣品分別裝入A管和B管，并與上述試劑盒所述試劑充分混合，所述A管裝有野生型正向引物或反向引物，B管裝有突變型正向引物或反向引物，所述A、B兩管內(nèi)的其余成分相同；
[0015]2)將步驟I)的混合液瞬時(shí)離心后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所述離心時(shí)間3s為最佳；
[0016]3)根據(jù)A管擴(kuò)增曲線CtA值與B管擴(kuò)增曲線CtB值的差值Λ Ct判斷目標(biāo)位點(diǎn)的基因類(lèi)型，優(yōu)選的，所述判斷標(biāo)準(zhǔn)為CtA-CtB〈-5，則該基因?yàn)橐吧?；CtA-CtB>5，則該基因?yàn)橥蛔冃?；|CtA-CtB|〈3，則該基因?yàn)殡s合型。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟I)中樣品為抗凝全血、尿液、精液、淋巴液、組織液或植物粗提液坐寸ο
[0018]優(yōu)選的，所述樣品的用量不大于I μ I。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟2)的擴(kuò)增過(guò)程分為預(yù)變性和循環(huán)兩個(gè)階段進(jìn)行，循環(huán)階段為兩溫循環(huán)或三溫循環(huán)，循環(huán)次數(shù)為40個(gè)或以上。
[0020]本發(fā)明的有益效果為:
[0021]1、樣品無(wú)須進(jìn)行DNA提取，只需微量即可檢測(cè)；
[0022]2、一管式反應(yīng)，可立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
[0023]3、DNA聚合酶的選擇上，采用更耐高溫及熱啟動(dòng)的酶，常溫運(yùn)輸儲(chǔ)存即可，無(wú)需冷鏈運(yùn)輸，大大降低了使用成本；
[0024]4、優(yōu)化了引物設(shè)計(jì)，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1CYP2C19基因681位點(diǎn)的熒光擴(kuò)增曲線圖(a)；
[0026]圖2CYP2C19基因681位點(diǎn)的熒光擴(kuò)增曲線圖(b)；
[0027]圖3CYP2C19基因681位點(diǎn)的熒光擴(kuò)增曲線圖(C)；
[0028]圖4ALDH2基因1510位點(diǎn)的熒光擴(kuò)增曲線圖(a)；
[0029]圖5ALDH2基因1510位點(diǎn)的熒光擴(kuò)增曲線圖(b)；
[0030]圖6ALDH2基因1510位點(diǎn)的熒光擴(kuò)增曲線圖(C)；
[0031]圖7經(jīng)堿基錯(cuò)配位置優(yōu)化后的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0032]圖8專(zhuān)利CN101235415B中實(shí)施例1方法的熒光擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0034]實(shí)施例1CYP2C19*1、*2 分型
[0035]CYP2C19*2是指681位點(diǎn)由G (鳥(niǎo)嘌呤)突變?yōu)锳 (腺嘌呤)。此突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素酶CYP2C19活性喪失，氯吡格雷藥效明顯減弱。為檢測(cè)此突變，引物探針序列設(shè)計(jì)如下，
[0036]正向引物:5’-CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3’ ；
[0037]野生型反向引物:5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTGCC-3’ ；
[0038]突變型反向引物:5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT-3’ ；
[0039]反向探針:5，-GAAAATTATTGCATATCTAAGAGAA-3，；
[0040]將Iul EDTA抗凝全血與DNA聚合酶，PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP，引物探針在兩個(gè)反應(yīng)管內(nèi)充分混合。A管裝有正向引物，野生型反向引物和反向探針出管裝有正向引物，突變型反向引物和反向探針。兩個(gè)管內(nèi)除了反向引物不同外，其余組分完全相同。每人份反應(yīng)液(25 μ I)包含 5ymol/L 正、反向引物各 I μ l,5ymol/L 探針 0.5 μ 1，lOmmol/LdNTP0.4 μ 1，DNA聚合酶0.1μ 1，2XPCR反應(yīng)緩沖液12.0 μ 1，超純水9 μ I以及1μ I全血。檢測(cè)采用Agilent ΜΧ3000Ρ熒光定量PCR儀。PCR擴(kuò)增檢測(cè)條件設(shè)為95°C 5分鐘，45個(gè)循環(huán)(98°C 10秒，60°C熒光檢測(cè)40秒)。
[0041]反應(yīng)結(jié)束后，打開(kāi)熒光擴(kuò)增曲線界面，把基線范圍設(shè)定為10至22，將閾值線拉至曲線熒光最大值的1/10處，即可得到兩個(gè)反應(yīng)的Ct值CtA和CtB。此處CtA為裝有野生型引物的反應(yīng)得到的Ct值，CtB為裝有突變型引物的反應(yīng)得到的Ct值。
[0042]結(jié)果判斷:如圖1所示，CtA-CtB〈_5，則CYP2C19基因681位點(diǎn)為突變型GG，可標(biāo)記為*1/*1 ;如圖2所示，CtA-CtB>5，則CYP2C19基因681位點(diǎn)為突變型AA，可標(biāo)記為*2/*2 ；如圖3所示，CtA-CtB|〈3，則CYP2C19基因681位點(diǎn)為雜合型GA，可標(biāo)記為*1/*2。
[0043]實(shí)施例2ALDH21510位點(diǎn)G — A突變檢測(cè)
[0044]ALDH2編碼乙醛脫氫酶，1510位點(diǎn)發(fā)生突變(G變?yōu)锳)將導(dǎo)致乙醛脫氫酶失活，此基因突變的患者無(wú)法代謝酒精以及硝酸甘油等藥物。為檢測(cè)此突變，引物探針序列設(shè)計(jì)如下，
[0045]野生型正向引