一種稻米香味基因的分子標(biāo)記和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種稻米香味基因的分子標(biāo)記和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國重要的農(nóng)作物，香味是高品質(zhì)稻米的一個重要特性，香稻因其優(yōu)良的香味品質(zhì)而為人們所喜愛，在國際稻米市場中占有重要地位，稻香味性狀和香稻育種的研宄也日益受到重視。選擇香型稻米是育種中最重要環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的香稻育種選擇方法是通過表現(xiàn)型間接對香味基因型或香味稻米進行選擇，這種方法存在周期長、效率低、準(zhǔn)確性較差等缺點。最有效的選擇，應(yīng)是直接對香味基因型進行選擇，香味功能基因的鑒定和功能性分子標(biāo)記的出現(xiàn)為這種直接選擇提供了可能。
[0003]編碼甜菜堿醛脫氫酶的ifei*盛因位于8號染色體，目前研宄發(fā)現(xiàn)ifei*盛因的第7外顯子中發(fā)生8bp缺失和3bp的變異，造成蛋白移碼突變，導(dǎo)致功能喪失，該等位基因,、％ badh2-E7。事實上，目前至少有8種功能喪失型的等位基因，但是badh2-E7是最為主要，衍生的香稻品種最多的一類等位基因。該位點突變導(dǎo)致甜菜醛脫氫酶基因也過之原有功能喪失，從而使甜菜醛脫氫酶的作用底物2-乙?；?1-吡咯啉的代謝途徑中斷，香味物質(zhì)2-乙酰基-1-吡咯啉不斷積累，致使水稻的葉片和籽粒產(chǎn)生香味。
[0004]針對如?/於-巧等位基因，目前已出現(xiàn)Indel等分子標(biāo)記應(yīng)用于基因分型，由于多態(tài)性差異不太明顯，使得其在應(yīng)用中存在一定局限性。而對于一般檢測而言，仍需要成本低、簡便實用、易于判別的共顯性標(biāo)記，用于便捷、高效地開展香稻分子輔助選擇育種。因此，設(shè)計開發(fā)新型的香味基因的功能性分子標(biāo)記顯得十分必要。
[0005]四引物擴增受阻突變體系PCR (ARMS-PCR)能夠針對多種突變進行特異等位擴增；針對已知的變異位點，于兩側(cè)分別設(shè)計I對外引物和I對特異性內(nèi)引物，特異性引物3’末端堿基必須落在突變點的位置上，從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。該技術(shù)具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有水稻香味基因檢測技術(shù)所存在的缺陷，提供一種鑒定稻米香味基因的分子標(biāo)記。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子標(biāo)記在鑒定稻米香味基因如過之-萬堪因型的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供上述分子標(biāo)記在鑒定稻米香味性狀中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米香味基因如萬堪因型的方法。
[0010]本發(fā)明的第五個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米香味性狀或同時鑒定稻米香味性狀和稻米香味基因badh2-E7m因型的方法。
[0011]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的:
一種稻米香味基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記名稱為badh2~E7-Y}k，由一對外引物Badh2-0-F 和 Badh2_0-R 和一對內(nèi)引物 Badh2-WT_F、Badh2_E7-R 組成，引物序列如 SEQ IDNO:1?4所示ο
[0012]本發(fā)明所述Badh2-WT_F、Badh2_E7-R引物的3’端引入錯配堿基。
[0013]發(fā)明人通過對水稻香味基因如在不同水稻品種中有香味與無香味的等位基因序列比較，分析得到兩者在編碼區(qū)第7外顯子存在8bp缺失和3bp的變異，設(shè)計涵蓋差異位點的功能標(biāo)記badh[E7-Yl該分子標(biāo)記擴增片段適中、特異性強。
[0014]本發(fā)明還提供上述分子標(biāo)記在鑒定稻米香味性狀和/或稻米香味基因badh2_E7基因型中的應(yīng)用。
[0015]還提供了上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0016]還提供了利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米香味基因如過之-萬堪因型的方法，具體地，包括以下步驟:
51.待測樣品DNA提取；
52.以樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用上述分子標(biāo)記進行PCR擴增；
53.分析PCR擴增后的產(chǎn)物，進行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)360bp和215bp條帶，則表明待測樣品的稻米香味基因如為香味基因型；若出現(xiàn)188bp和368bp條帶，則表明待測樣品的稻米香味基因如為純合的無香味基因型；若出現(xiàn)360bp/368bp、188bp和215bp條帶，則表明待測樣品的稻米香味基因badh2_E7%架合飽無香味基因型。
[0017]還提供了利用上述分子標(biāo)記鑒定稻米香味性狀或同時鑒定稻米香味性狀和稻米香味基因如堪因型的方法，具體地，包括以下步驟:
51.待測樣品DNA提??；
52.以樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用上述分子標(biāo)記進行PCR擴增；
53.分析PCR擴增后的產(chǎn)物，進行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)360bp和215bp條帶，則表明待測樣品的稻米香味基因如為香味基因型，待測樣品為香型稻米；若出現(xiàn)188bp和368bp條帶，則表明待測樣品的稻米香味基因如過之-^7為純合的無香味基因型，待測樣品為非香型稻米；若出現(xiàn)360bp/368bp、188bp和215bp條帶，貝丨」表明待測樣品的稻米香味基因如為雜合的無香味基因型，待測樣品為非香型稻米。
[0018]優(yōu)選地，上述方法中，所述PCR反應(yīng)體系為:DNA模板1.0 uL、Badh2-WT_F 0.3 uL、Badh2-E7-R 0.3 uL、Badh2-0_F0.3 uL、Badh2_0-R 0.3 uL、2XPower Taq PCR Master Mix
7.5uL，用雙蒸滅菌水補足至15uL。
[0019]優(yōu)選地，上述方法中，所述PCR擴增的條件為:94°C預(yù)變性5min，94 °C 30s,57°C 30s，72°C 45s共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸1min。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明基于ARMS-PCR原理，設(shè)計了一種鑒定稻米香味基因的基因型的分子標(biāo)記，該標(biāo)記擴增片段適中、特異性強；利用該標(biāo)記僅僅通過簡單的PCR，可對稻米香味基因badh2-E7進行基因分型，香味水稻和無香味水稻品種，利用該標(biāo)記可實現(xiàn)對水稻稻米香味性狀的分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說明】
[0021]圖1是badh2-E7_FM引物設(shè)計示意圖；其中等位變異位點分別以紅色背景標(biāo)識。
[0022]圖2是badh2-E7-Yl擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分型；其中，M:DNA ladder ; 1:華占/Basmati370 ;2:華占；3:日本晴；4:Basmati370 ；5:象牙香占；6 ?15:華占 /Basmati370的BC1F2回交選擇單株。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024]實施例1水稻如過之-萬蹲位基因功能性標(biāo)記badh2-E7_FM的引物設(shè)計
1、引物設(shè)計
通過對水稻香味基因如在不同水稻品種中有香味與無香味的等位基因序列比較，分析得到兩者在編碼區(qū)第7外顯子存在8bp缺失和3bp的變異，設(shè)計涵蓋差異位點的功能標(biāo)記 badh[E7-Y}k (圖1)。所述的 badh[E7-Y}k 由 4 個引物 Badh2-WT_F、Badh2_E7-R、Badh2-0-F和Badh2-0-R構(gòu)成，引物序列(5’ -3，)如下:
Badh2-WT-F:GGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGABadh2_E7-R:aaccataggagcagctgaaataBadh2-0_F:cttccttcaggtgtgctaaacaBadh2-0-R:GAATGATGCTCAAAGTGTCTTGA(引物序列中加框的堿基為等位變異堿基)
2、預(yù)期擴增片段分析
用上述四個引物對水稻如基因進行擴增，有香味等位基因(如過士萬摩6合型)、無香味等位基因(fei*士F7純合型)和雜合型，都能利用Badh2-0-F和Badh2-0-R擴增出大小為360 bp或368 bp的條帶，此帶可以用于PCR擴增與否的監(jiān)測。此外，有香味等位基因(如過士巧純合型)還能利用Badh2-E7-R和Badh2-0_F擴增出一條215 bp的條帶；無香味等位基因(fei*士F7純合型)能利用Badh2-WT-F和Badh2_0-R擴增出一條188 bp的條帶；雜合型既能擴增出215 bp的條帶又能擴增出188 bp的條帶。
[0025]實施例2利用如分子標(biāo)記鑒定5個水稻品種香味基因型 1、水稻基因組DNA的提取
以5個水稻品種為材料:華占/Basmati370、華占、日本晴、Basmati370和象牙香占。選取水稻單株嫩葉，采用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下:(I)取適量新鮮葉片放在2 mL離心管中加液氮搗碎，向離心管中加入I mL CTAB抽提液，搖勻；(2)置于65°C的水浴鍋或恒溫箱，每隔1min輕輕搖動一次，30?45min后取出；(3)冷卻2 min后，加入氯仿-異戊醇(24:1)至滿管，上下劇烈搖動，使兩者混合均勻；(4)離心管放入離心機中15, 000 r/min離心10 min后取出；(5)小心吸取上清液至新的滅菌離心管中，然后加入600μ L預(yù)冷的