用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測(cè)的引物組、方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種PCR擴(kuò)增方法，尤其涉及一種用于乳腺癌易 感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測(cè)的引物組、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌而位居第二 位。BRCA(breast cancer susceptibility gene)是遺傳性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其 與乳腺癌密切相關(guān)。自BRCA1和BRCA2基因成功地定位、分離后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣 泛、深入的研宄。在我國(guó)的許多大中城市，乳腺癌已占婦女惡性腫瘤死因的首位，嚴(yán)重威脅 著女性健康。
[0003] 早診斷早發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病情的治愈還是相當(dāng)樂(lè)觀的。在第IV期得到診斷的乳腺癌 患者只有20%能夠存活到5年之后，而在第I期就診的患者100%活到5年之后。因此乳腺 癌的早期診斷是目前亟待解決的問(wèn)題。
[0004] BRCA1和BRCA2為乳腺癌遺傳性主要的風(fēng)險(xiǎn)因子。二者都是抑癌基因，均呈常染色 體顯性遺傳，且容易引發(fā)早年發(fā)病。BRCA1基因定位于17q21，編碼BRCA1蛋白含1863個(gè)氨 基酸，在維持細(xì)胞正常增殖、分化中發(fā)揮重要作用，并參與DNA損傷修復(fù)功能，是第一個(gè)被 證實(shí)和克隆的BRCA。BRCA1基因突變會(huì)引發(fā)DNA修復(fù)功能障礙，使細(xì)胞代謝和增殖紊亂，促 進(jìn)細(xì)胞惡變和腫瘤發(fā)生。
[0005] BRCA2基因位于13ql2,編碼BRCA2蛋白含3418個(gè)氨基酸，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)有重 要作用。BRCA2變異范圍達(dá)整個(gè)基因的編碼區(qū)，目前尚未發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)的變異。BRCA2基因 發(fā)生突變后表達(dá)的蛋白質(zhì)失去了修復(fù)DNA損傷的功能，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。 總之，BRCA1和BRCA2突變、功能缺失，造成基因不穩(wěn)定，逃避集體防御體系監(jiān)視，使細(xì)胞非 控制性增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。
[0006] 有研宄表明，有5%~10%的乳腺癌和10%~15%的卵巢癌是由BRCA1/2突變引起的， 而在乳腺癌和卵巢癌高發(fā)家族中80%的患者BRCA1/2基因存在突變。與正常女性相比，攜 帶BRCA1或BRCA2基因突變的女性，患乳腺癌或卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)高5-20倍，一生中可能有 45%-65%的概率患乳腺癌，11%-40%的概率患卵巢癌，且易早年發(fā)病[2, 3]。 據(jù)報(bào)道，乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因檢測(cè)方法有很多，Ozcelik H等曾利用 Long-range PCR擴(kuò)增BRCA1和BRCA2兩個(gè)基因全基因，設(shè)計(jì)17對(duì)引物，采用invitrogen公 司的SequalPrep Long PCR體系擴(kuò)增，由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度太長(zhǎng)，引物設(shè)計(jì)區(qū)域不恰當(dāng)，導(dǎo)致 出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物中非特異帶型較多，干擾BRCA1和BRCA2目標(biāo)區(qū)域富集[4]。利用多重PCR技 術(shù)將BRCA1和BRCA2外顯子區(qū)域擴(kuò)增富集，需設(shè)計(jì)200多對(duì)引物分到不同PCR體系中。同 樣擴(kuò)增片段、引物設(shè)計(jì)、退火溫度和延伸時(shí)間優(yōu)化不恰當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致非特異性條帶的增多，可 能有10幾對(duì)引物混合在一個(gè)反應(yīng)中，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致交互配對(duì)或增加錯(cuò)配產(chǎn)物，影響目標(biāo)區(qū)域 擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。
[0007] 因此本領(lǐng)域迫切需要建立新的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2檢測(cè)技術(shù)，而通過(guò) 對(duì)樣本的BRCA1和BRCA2的Long-range PCR擴(kuò)增，可更全面準(zhǔn)確的評(píng)估患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。 能夠早期客觀、靈敏和穩(wěn)定的檢測(cè)BRCA1和BRCA2基因突變，以便進(jìn)行及時(shí)、有針對(duì)性的治 療或預(yù)防乳腺癌，降低醫(yī)療成本，節(jié)約社會(huì)資源。
[0008] 參考文獻(xiàn)：
[1]登云特，王國(guó)平.乳腺癌易感基因BRCA1/2的研宄進(jìn)展[J/CN].中國(guó)乳腺病雜志： 電子版，2013,7(5):374-378.
[2] 黃清豐，李茹捧，付倩，呂晶，張?zhí)m.基因?qū)虻娜橄侔┲委熯M(jìn)展研宄[J].中國(guó) 醫(yī)藥指南.2014, 12(6) : 39.
[3] Antoniou A, Pharoah P D, Narod S, et al: Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies. Am J Hum Genet, 2003,72:1117-1130.
[4] Ozcelik H, Shi X, Chang MC, et al. Long-range PCR and next-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. J Mol Diagn. 2012;14:467 - 475。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要目的是提供用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR 檢測(cè)的引物組，以及提供一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測(cè) 的方法和試劑盒，以優(yōu)化的Long-range PCR方法代替其他PCR方法進(jìn)行檢測(cè)分析。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測(cè)的引物組，包括用于 特異性擴(kuò)增乳腺癌易感基因BRCA1的10個(gè)引物對(duì)和用于特異性擴(kuò)增乳腺癌易感基因BRCA2 的8個(gè)引物對(duì)，其中，用于特異性擴(kuò)增乳腺癌易感基因BRCA1的10個(gè)引物對(duì)中包含以下3 個(gè)引物對(duì)： (1) 引物對(duì)1 : 正向引物BR1_P6. 1F :5' -ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3' 反向引物BR1_P6. 1R:5' -TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3' (2) 引物對(duì)2 : 正向引物BR1_P6. 2F :5' - CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3' 反向引物BR1_P6.2R:5' - AGCITTGTGGTGAGGTGITG -3' (3) 引物對(duì)3 : 正向引物BR1_P7F:5' - GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3' 反向引物BR1_P7R:5' - AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3'。
[0011]本發(fā)明的另一種目的是提供一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的 Long-range PCR檢測(cè)的方法，包括以下步驟： A. 利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒（DP304)對(duì)采集 的樣本進(jìn)行DNA提??； B. 利用總共18個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行目標(biāo)序列的Long-range PCR擴(kuò)增，其中BRCA1需要 10個(gè)引物對(duì)進(jìn)行10個(gè)片段的擴(kuò)增，所述10個(gè)引物對(duì)中包含下述3個(gè)引物對(duì)： (1) 引物對(duì)1 : 正向引物 BR1_P6. 1F :5' -ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3' 反向引物 BR1_P6. 1R:5' -TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3' (2) 引物對(duì)2 : 正向引物 BR1_P6. 2F :5' - CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3' 反向引物 BR1_P6.2R:5' - AGCITTGTGGTGAGGTGITG -3' (3) 引物對(duì)3 : 正向引物 BR1_P7F:5' - GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3' 反向引物 BR1_P7R:5' - AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3'， BRCA2需要8個(gè)引物對(duì)進(jìn)行8個(gè)片段的擴(kuò)增； C. QIAquick Gel Extraction Kit 回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，Invitrogen Qubit2.0測(cè)定PCR 產(chǎn)物濃度； D. 將純化后的擴(kuò)增子等摩爾混合； E. 以lug混合后的擴(kuò)增子進(jìn)行小片段文庫(kù)構(gòu)建； F?對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行 2100 Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及 QPCR 檢 測(cè)，利用Illumina HiSeq? 2500對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的Long-range PCR擴(kuò)增體系如下： SequalPr印10X反應(yīng)緩沖液(包括Mg 2+和dNTPs) 2ul SequalPr印 PCR 增強(qiáng)劑 2ul 二甲基亞砜DMSO 0. 4ul 引物對(duì)（2. 5umol/L) lul SequalPrep Long 聚合酶 0? 25ul DNA 模板 50ng ddH20 加至 20ul。