因組突變的直接檢測(cè)、產(chǎn)前基因診斷、其它涉及有限的DNA投入(input)和高精確率的遺傳診斷。
[0032]根據(jù)本文一些實(shí)施方案的測(cè)序，可以允許與之前的方法相比精確度>10，000倍高的單個(gè)細(xì)胞基因組測(cè)序。一些實(shí)施方案利用在單個(gè)雙鏈核酸的沃森和克里克鏈中(例如在染色體中)編碼的冗余遺傳信息來克服體外擴(kuò)增錯(cuò)誤的問題。鏈及其互補(bǔ)鏈能夠各自進(jìn)行測(cè)序，并且兩條鏈的序列能夠進(jìn)行比較。如果在兩條鏈的確定序列之間存在差異，這種差異是更可能代表體外測(cè)序錯(cuò)誤而不是真正的突變。在一些實(shí)施方案中，所述鏈的序列與參考序列進(jìn)行比較。如果兩條序列鏈彼此一致，但與參考序列不同，所述鏈最可能含有相對(duì)于參考序列的突變或變異。示例性的突變或變異包括但不限于:單個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNPs)、缺失、插入、重復(fù)和倒位。在一些實(shí)施方案中，所述參考序列是來自相同生物的不同細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述參考序列是來自不同的、相關(guān)生物的細(xì)胞(例如，相同物種的生物或系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的物種的生物)。
[0033]在一些實(shí)施方案中，提供了允許單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組測(cè)序的?10_1(1的共有(consensus)錯(cuò)誤率以對(duì)單個(gè)人類細(xì)胞直接測(cè)量體細(xì)胞突變的技術(shù)。
[0034]為此，在一些實(shí)施方案中提供了SISSOR(Single-Stranded Sequencing usingmicrOfluidic Reactors，采用微流控反應(yīng)器的單鏈測(cè)序)。SISSOR利用在單個(gè)細(xì)胞的沃森和克里克鏈中編碼的冗余遺傳信息來克服體外擴(kuò)增錯(cuò)誤的問題。SISSOR可以包括分開單個(gè)細(xì)胞中的雙鏈核酸分子的兩條互補(bǔ)鏈用于獨(dú)立擴(kuò)增和測(cè)序，和采用來自沃森和克里克鏈的冗余測(cè)序數(shù)據(jù)從數(shù)以千計(jì)至數(shù)以萬計(jì)的測(cè)序錯(cuò)誤中區(qū)分每個(gè)基因組幾十個(gè)真正的突變。理論上，在根據(jù)本文的一些實(shí)施方案的SISSOR中，當(dāng)DNA的兩條互補(bǔ)鏈以10_6的錯(cuò)誤率在體外分別進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，人們能夠?qū)崿F(xiàn)10_12的錯(cuò)誤率，并且僅當(dāng)來自兩條鏈的測(cè)序數(shù)據(jù)一致時(shí)所述突變被識(shí)別?；诹硗獾腻e(cuò)誤源，包括嵌合序列、測(cè)序儀器的硬件噪音和計(jì)算作圖錯(cuò)誤，根據(jù)本文的一些實(shí)施方案，10_1(1的錯(cuò)誤率是可以實(shí)現(xiàn)的。從DNA分子的兩條沃森和克里克鏈獲得序列信息的概念常常被用于細(xì)菌克隆的Sanger測(cè)序中，如在人類基因組計(jì)劃中人類參考基因組的產(chǎn)生。最近，相關(guān)概念被應(yīng)用與第二代測(cè)序技術(shù)的精確度的改進(jìn)(Schmitt et al.2012)。但是，就申請(qǐng)人所知道的，本文的實(shí)施方案代表了基于創(chuàng)新的微流控平臺(tái)在單個(gè)細(xì)胞上第一次實(shí)現(xiàn)單鏈測(cè)序。
[0035]測(cè)序方法
[0036]根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了對(duì)來自單個(gè)細(xì)胞的雙鏈核酸進(jìn)行測(cè)序的方法。所述方法可以包括從所述細(xì)胞分離多個(gè)雙鏈核酸、分開雙鏈核酸的鏈。所述方法可以包括將所述鏈置于多個(gè)溶液中，其中所述多個(gè)溶液中每一個(gè)與每個(gè)其它溶液分開，其中所述多個(gè)溶液中每一個(gè)具有大約4nl或更少的體積，并且其中在每個(gè)溶液中鏈的數(shù)量基本上類似。所述方法可以包括對(duì)所述鏈進(jìn)行測(cè)序。
[0037]各種雙鏈核酸可以被用于根據(jù)本文的實(shí)施方案，例如DNA、RNA或DNA-RNA雜交體?？杀挥糜诟鶕?jù)本文的實(shí)施方案的示例性的雙鏈核酸包括染色體、小型染色體(minisome)、游離體(episome)、質(zhì)?；蛉魏嗡许?xiàng)的片段。雖然在本文的幾個(gè)示例性的實(shí)施方案中討論了染色體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地認(rèn)識(shí)到其它雙鏈多核苷酸可以被用于根據(jù)本文所公開的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，所述片段具有至少大約10kb的長(zhǎng)度，例如大約 100kb、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10，000,20, 000,30, 000 或 40，OOOkb0
[0038]各種類型的單個(gè)細(xì)胞可以被用于根據(jù)本文的實(shí)施方案，例如，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞、配子、胚胎干細(xì)胞、多能(pluripotent)干細(xì)胞(包括誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)、成人干細(xì)胞、造血譜系的細(xì)胞、多細(xì)胞生物的分化的體細(xì)胞、微生物細(xì)胞、癌細(xì)胞(包括例如癌癥干細(xì)胞)、疾病的細(xì)胞等。
[0039]圖4是表示根據(jù)本文的一些實(shí)施方案的對(duì)單個(gè)細(xì)胞的雙鏈核酸進(jìn)行測(cè)序的方法的流程圖。所述方法可以包括分離單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)雙鏈核酸，其中所述多個(gè)中每一個(gè)雙鏈核酸可以包含核酸第一鏈和核酸第二鏈，并且所述核酸第一鏈和核酸第二鏈彼此互補(bǔ)400。所述方法可以包括將所述多個(gè)雙鏈核酸中每個(gè)雙鏈核酸的所述核酸第二鏈與所述核酸第一鏈分離410。所述方法可以包括將所述多個(gè)染色體的所述第一鏈和第二鏈置于多個(gè)溶液中，其中所述多個(gè)溶液中每一個(gè)與每個(gè)其它溶液分開，并且其中所述多個(gè)溶液中每一個(gè)具有大約4nl或更少的體積，并且其中在每個(gè)溶液中的鏈的數(shù)量基本上類似420。所述方法可以包括擴(kuò)增每條鏈430。在一些實(shí)施方案中，每條鏈被擴(kuò)增不超過大約10，000倍，例如不超過大約1，000倍。所述方法可以包括對(duì)每條鏈進(jìn)行測(cè)序440。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括互相比較兩條互補(bǔ)鏈的序列450。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述互補(bǔ)鏈的序列與參考序列進(jìn)行比較460。在一些實(shí)施方案中，在單個(gè)微流控裝置中進(jìn)行整個(gè)方法。在一些實(shí)施方案中，在單個(gè)微流控裝置中貫穿整個(gè)擴(kuò)增實(shí)施所述方法430，在該點(diǎn)核酸的鏈被從微流控裝置中取出，并用于構(gòu)建測(cè)序文庫。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)于本文所公開的該過程和方法與其它過程和方法，在所述過程和方法中進(jìn)行的功能可用不同順序進(jìn)行。另外，所概述步驟和操作僅作為例子提供，而一些步驟和操作可以是可選的，被組合成更少的步驟和操作、或被擴(kuò)展成另外的步驟和操作而不脫離所公開的實(shí)施方案的本質(zhì)。
[0040]本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，根據(jù)本文的實(shí)施方案，各種技術(shù)可以被用于從所述細(xì)胞分離核酸。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被裂解，例如通過凍融循環(huán)(例如，在液氮中)、將所述細(xì)胞與堿性溶液(例如，氫氧化鉀、氫氧化鈉或另一種合適的強(qiáng)堿性溶液)接觸、或?qū)⒓?xì)胞與鹽溶液(如N-月桂酰肌氨酸鹽)接觸。
[0041]在一些實(shí)施方案中，將所述多個(gè)雙鏈核酸(例如，染色體)的所述第一鏈置于多個(gè)溶液，包括分開所述鏈并將所述鏈在多個(gè)溶液中進(jìn)行分配。所述鏈可以被通過各種方法分配，例如，機(jī)械旋轉(zhuǎn)或被動(dòng)擴(kuò)散。各種方法可以被用于將所述鏈分開，例如，堿變性或熱變性。因此，在一些實(shí)施方案中，堿性溶液是用來既從細(xì)胞中分離核酸又將核酸的所述鏈分開。
[0042]在一些實(shí)施方案中，所述鏈通過將所述互補(bǔ)鏈彼此分開而被分配，并且然后溫和地機(jī)械旋轉(zhuǎn)所述鏈。不被任何特定的理論限制，溫和的機(jī)械旋轉(zhuǎn)可以使得單鏈多核苷酸的剪切最小化。溫和的機(jī)械旋轉(zhuǎn)可以在旋轉(zhuǎn)構(gòu)件中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行混合涉及打開和關(guān)閉與所述旋轉(zhuǎn)構(gòu)件流體連通的多個(gè)閥。在一些實(shí)施方案中，所述旋轉(zhuǎn)構(gòu)件包含環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所述鏈被彼此分開，并且然后被置于所述旋轉(zhuǎn)構(gòu)件中。在一些實(shí)施方案中，所述鏈被置于所述旋轉(zhuǎn)構(gòu)件中，并且然后被彼此分開。機(jī)械旋轉(zhuǎn)之后，所述鏈可以被在多個(gè)溶液中分配。
[0043]在一些實(shí)施方案中，通過將所述互補(bǔ)鏈彼此分開而分配所述鏈，并且然后被動(dòng)擴(kuò)散所述鏈進(jìn)入多個(gè)溶液。在一些實(shí)施方案中，所述鏈被置于被動(dòng)擴(kuò)散器中，其包含與所述多個(gè)溶液流體連通的被動(dòng)擴(kuò)散膜。在一些實(shí)施方案中，所述鏈?zhǔn)紫缺舜朔珠_，并且然后被置于所述被動(dòng)擴(kuò)散器中。在一些實(shí)施方案中，所述鏈被置于所述被動(dòng)擴(kuò)散器中，然后彼此分開再擴(kuò)散進(jìn)入所述多個(gè)溶液。
[0044]通過在多個(gè)不同溶液中分配所述鏈，對(duì)于每條染色體(或其它雙鏈多核苷酸)，所述互補(bǔ)的核酸在分開的溶液中的可能性可非常高。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于每條染色體，所述互補(bǔ)的核酸在分開的溶液中的可能性為至少95%，例如大約95.1%,96%,97%,98%,99 %、99.5 %、99.9 %或99.99 %。對(duì)于所有雙鏈多核苷酸的互補(bǔ)鏈在分開的溶液中的可能性可能取決于不同的雙鏈多核苷酸的數(shù)量，其可以被單個(gè)細(xì)胞中的染色體數(shù)量和單個(gè)細(xì)胞的倍性所影響，并且因此，需要提供特定可能性的不同溶液數(shù)量可以不同。值得注意的是，通常，單個(gè)細(xì)胞中染色體(或雙鏈核酸)的總數(shù)越低，所述鏈被分配使得所述互補(bǔ)核酸在分開的溶液中的可能性越高。在一些實(shí)施方案中，24個(gè)不同溶液提供相同的雙鏈多核苷酸的兩條鏈不在相同的溶液中的可能性大于95%。24個(gè)不同溶液能夠確保對(duì)于二倍體人類基因組(23個(gè)染色體對(duì))和二倍體小鼠基因組(19個(gè)染色體對(duì))該至少95%的可能性，注意的是，由于二倍體小鼠比二倍體人類具有更少的染色體，對(duì)于二倍體小鼠，所述可能性會(huì)比二倍體人類稍微更高。在一些實(shí)施方案中，有至少10個(gè)不同溶液，例如，10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、、60、70、80、90 或 100 個(gè)不同溶液。在一些實(shí)施方案中，所述不同溶液被放置于微流控裝置中。在一些實(shí)施方案中，所述不同溶液與如本文所述的構(gòu)件流體連通。
[0045]在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)溶液中每一個(gè)具有4nl或更少的體積，例如大約4nl、4nl、3.5nl、3nl、2.5nl、2nl、l.5η1、1η1、0.5η1、0.4η1、0.3η1、0.2η1、0.1η1、0.09η1、0.05η1和0.0lnl，包括所列值的任意兩個(gè)之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)溶液中每一個(gè)具有2nl或更少的體積。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)溶液中每一個(gè)具有Inl或更少的體積。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)溶液中每一個(gè)具有0.4nl或更少的體積。
[0046]在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)序包括在所述溶液中對(duì)每條鏈進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增包括多重置換擴(kuò)增。不被任何特定的理論限制，已經(jīng)可以在本文中觀察到大約1000倍或更少的每條鏈的擴(kuò)增產(chǎn)生沿著每個(gè)核酸非常均一的擴(kuò)增(參見例如圖1和3)。此外，不被任何特定的理論限制，雖然1000倍的擴(kuò)增產(chǎn)生相對(duì)于大基因組(如人類和小鼠)非常均一的擴(kuò)增，本文包括對(duì)于更小基因組可以用基本上更高倍數(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)生均一性。因此，在一些實(shí)施方案中，每條鏈被擴(kuò)增不超過大約10，000倍，例如，不超過大約10，000 倍、9000 倍、8000 倍、7000 倍、6000 倍、5000 倍、4000 倍、3000 倍、2000 倍、1500 倍、1400 倍、1300 倍、1200 倍、1100 倍、1000 倍、950 倍、900 倍、850 倍、800 倍、750 倍、700 倍、650倍、600 倍、550 倍、500 倍、450 倍、400 倍、350 倍、300 倍、250 倍、200 倍、150 倍、或 100 倍。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序包括擴(kuò)增每條鏈大約100倍一 1000倍、大約200倍一 1000倍、大約300倍一 1000倍、大約400倍一 1000倍、大約500倍一 1000倍、大約600倍一 1000倍、大約700倍一 1000倍、大約800倍一 1000倍、大約900倍一 1000倍、大約950倍一 1000倍、大約100倍一 900倍、大約200倍一 900倍、大約300倍一 900倍、大約400倍一 900倍、大約500倍一 900倍、大約600倍一 900倍、大約700倍一 900倍、大約800倍一 900倍、大約100倍一 800倍、大約200倍一 800倍、大約300倍一 800倍、大約400倍一 800倍、大約500倍一 800倍、大約600倍一 800倍或大約700倍一 800倍。
[0047]期望的倍數(shù)擴(kuò)增可以通過各種方法實(shí)現(xiàn)，例如反應(yīng)體積、試劑的選擇、試劑的濃度、反應(yīng)條件(如溫度等)和反應(yīng)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)時(shí)間被用于控制所述倍數(shù)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，每條鏈被擴(kuò)增不超過24小時(shí)，例如大約24小時(shí)、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 小時(shí)。對(duì)于許多應(yīng)用(例如，用于許多基因組大小)，擴(kuò)增不超過5小時(shí)可能是合適的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，這可