一種重組h9n2亞型禽流感加強(qiáng)型多表位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種重組H9N2亞型禽流感加強(qiáng)型 多表位疫苗制備與應(yīng)用。具體地，利用基因重組技術(shù)，將主要結(jié)構(gòu)蛋白：血凝素（HA)、神經(jīng) 氨酸酶（NA)、核衣殼蛋白（NP)和基質(zhì)蛋白2 (M2)的中和表位、Th表位、CTL表位以及B細(xì) 胞表位與細(xì)胞因子禽IL-18串聯(lián)，并克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化、乳化工藝制 備，得到重組H9N2亞型禽流感多表位疫苗以及該疫苗在預(yù)防禽傳染性疾病H9N2亞型禽流 感中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒可分為A、B和C三型。其中B型和C型流感病毒的分布范圍較小，危 害較輕，而A型流感病毒的危害最為嚴(yán)重，除感染人類(lèi)外，還可以感染其它的哺乳動(dòng)物和 鳥(niǎo)類(lèi)（Webster，1992)，并且可引起世界性流感大流行，對(duì)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成 重大的打擊（Al-Mazrou A etal，1991 ;)。血凝素（hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶 (neuraminidase，NA)是流感病毒2種主要的表面糖蛋白和表面抗原，具有亞型特異性，根 據(jù)HA和NA的不同，A型流感病毒又可分為17種HA(H1-H17)和10種NA(Nl-NlO)亞型（Zhu， 2013)，其中 H1N1，H2N2 和 H3N2 在人類(lèi)中流行（Earn，2002 ;Fouchier，2004)。LPAIV 在世界 范圍內(nèi)廣泛傳播，并突破種間屏障傳染給人和豬（Alice，2011 ;Ge，2009 ;Park，2011)。1966 年，H9N2亞型AIV首次從美國(guó)火雞群中分離出來(lái)，自1997年以來(lái)，H9N2亞型AIV在亞洲、 北美、中東、歐洲和非洲地區(qū)的禽類(lèi)中傳播流行，偶爾突破種間屏障傳染給人（Alice，2011 ; Ge，2009 ;Park，2011)。自此以后H9N2亞型AIV-直在我國(guó)主要的養(yǎng)禽地區(qū)廣泛傳播。H9N2 亞型AIV雖屬于LPAIV，但其可引起呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降、免疫抑制以及激發(fā)其它病毒 或者細(xì)菌混合感染，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Chen，2012 ;Wu，2010)。
[0003] H9亞型流感病毒廣泛分布于世界各地，特別是在歐亞大陸。根據(jù)其基因進(jìn)化的關(guān) 系，它與其它亞型一樣，可以分為北美系列和歐亞系列。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有三個(gè)歐亞系列 的亞系列（Guan Y，1999)，分別以 Qa/HK/Gl/97、DK/HK/Y280/97、DK/HK/Y439/97 為代表。
[0004] 流感病毒的基因組由8個(gè)基因片段組成，共編碼12種或更多的蛋白，其中8種是 結(jié)構(gòu)蛋白，包括聚合酶B2(polymerase B2，PB2)，聚合酶BI (polymerase B1，PB1)，聚合酶 △(卩〇1}0116四86六，？六），碰，即，嫩，]\11和]\12，非結(jié)構(gòu)蛋白（11〇1181：1'11(31：11四1。1'〇七6；[11，呢）包括 NSl和NS2, PA基因編碼的PA-X是流感病毒的一種融合蛋白（Shi，2012)，PBl基因編碼的 PB1-F2與流感病毒粒子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)（chen W，2001)。
[0005] HA能凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，是流感病毒的一種表面蛋白，它能結(jié)合到宿主細(xì)胞 表面的唾液酸受體上，幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中并改變病毒的抗原性，進(jìn)而逃逸宿主免疫 系統(tǒng)的監(jiān)視，是病毒變異、毒力和宿主特異性的主要決定因素（Guo, 2000 ;Kimble，2011)。 HA基因是產(chǎn)生中和抗體的抗原，誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用，是病毒變異、毒力和宿主 特異性的主要決定因素，而且還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)反應(yīng)，是AIV 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫反應(yīng)的靶抗原。HA蛋白氨基酸的改變與病毒抗原性變異密切 相關(guān)，并且可能改變病毒的宿主特異性（Krause，2010 ;Carrat，2007)。
[0006] NA蛋白是流感病毒粒子的另外一種重要的表面抗原，具有免疫原性，能誘導(dǎo)相 應(yīng)抗體的產(chǎn)生。NA誘發(fā)的相應(yīng)抗體不屬于中和抗體，但可抑制病毒在體內(nèi)的擴(kuò)散（Hay， 1998)。NA蛋白能裂解受體表面糖蛋白末端的唾液酸，使子代病毒離子從細(xì)胞中釋放出來(lái)， 有利于病毒的傳播（Castrucci，1993)。
[0007] NP是由基因組片段5編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成核衣殼的主要成分。一般認(rèn)為，NP 是保守的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒進(jìn)化過(guò)程中變異率很低，具有型特異性。根據(jù)其抗原性的不同， 可將流感病毒分為A型、B型、C型。NP在確定病毒的宿主特異性方面也有作用，是流感病 毒基因組中最為保守的一個(gè)片段，具有型特異性。NP是一種多功能蛋白，可形成病毒的核衣 殼，與聚合酶和RNA共同形成RNP復(fù)合體，防止vRNA分解，在病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中也具有 重要的作用（Bullido et al.，2000)。NP為核蛋白，富含精、甘、絲氨酸，為一種堿性蛋白， 引起宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答（Lamb，1982 ;Portela，2002)，是螺旋形核衣殼的主軸，也是CTL (細(xì) 胞毒淋巴細(xì)胞）的識(shí)別靶位。
[0008] M為疏水性蛋白，富含精氨酸，包括Ml和M2兩種蛋白質(zhì)（Treanor，1990)，其中M2 的胞外區(qū)M2e序列高度保守，雖然M2抗體沒(méi)有中和活性，但小鼠實(shí)驗(yàn)表明，使用M2e單抗被 動(dòng)免疫能夠明顯降低小鼠鼻部和肺部的病毒滴度（Jegerlehner，2004)。研宄表明M2e抗體 主要通過(guò)抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷（ADCC)發(fā)揮作用的（Okuda，2001 ;Neirynck，1999 ; Fan，2004)〇
[0009] 流感病毒的兩個(gè)表面糖蛋白易發(fā)生變異，宿主產(chǎn)生的保護(hù)性抗體也是針對(duì)這兩種 蛋白的，體液免疫又可促使抗原變異（Corti，2011)，尤其是某些區(qū)域如HAI的抗原變異，導(dǎo) 致新的流行毒株或某些壽命短的亞進(jìn)化分支的出現(xiàn)。而細(xì)胞免疫如MHC I限制的CTL反應(yīng) 主要是針對(duì)比較保守的內(nèi)部蛋白（Forrest，2008)，并且不同亞型和毒株間有交叉反應(yīng)性， CTL的表位也可發(fā)生變異，流感病毒的進(jìn)化則主要是抗體的選擇。流感病毒感染的早期，CTL 和細(xì)胞因子等細(xì)胞免疫方面在限制病毒擴(kuò)散等方面起一定作用。在感染后期，中和抗體的 產(chǎn)生對(duì)病毒的清除和宿主恢復(fù)起重要作用。雖然HA和NA是流感病毒最具抗原性的蛋白， 但只有選擇保守的成分，才能減少抗原變化帶來(lái)的影響，從而抵抗大多數(shù)毒株的攻擊，起到 廣泛的保護(hù)作用（Ekiert，2009 ;Ernst，2006 ;)。
[0010] 當(dāng)前，人流感和禽流感的預(yù)防主要依賴(lài)于滅活疫苗以及減毒活疫苗長(zhǎng)期的使用經(jīng) 歷證明它們是安全有效的，并發(fā)揮了巨大的作用。疫苗免疫增強(qiáng)了機(jī)體的抵抗能力，減少了 病毒的排出和傳播?，F(xiàn)階段用于防制禽流感的疫苗主要為依靠雞胚增殖生產(chǎn)的滅活苗，雖 然傳統(tǒng)的滅活苗存在很多優(yōu)點(diǎn)，但仍有許多不足之處，如干擾流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，依靠雞胚增殖 成本高，在雞胚中傳代易發(fā)生變異，焚燒雞胚殘?bào)w污染環(huán)境等，且滅活苗與活毒苗均無(wú)法有 效應(yīng)對(duì)現(xiàn)在流感病毒變異迅速、多亞型流感并存流行、種屬界限日益模糊的趨勢(shì)。因而需要 進(jìn)一步加強(qiáng)新型疫苗的研制。
[0011] 白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18, IL-18)是一種1995年首次報(bào)道的新型細(xì) 胞免疫調(diào)節(jié)因子（Okamura，1995)，2000 年 Schneider 等（Schneider，2000)首次獲得雞 IL-18cDNA。白介素18具有誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ (Kohno，1997)，促進(jìn)T細(xì)胞 增殖，增強(qiáng)Thl細(xì)胞及NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性等多種生物學(xué)功能（Micallef，1996)，在增強(qiáng) 免疫、抗腫瘤等方面具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值（Kanda，2000 ;Marshall，2006)，在機(jī)體免疫 應(yīng)答，尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答中的一種重要細(xì)胞因子，可作為疫苗的免疫佐劑（Degen，2005 ; Puehler,2003)〇
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明以H9N2亞型禽流感病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白血凝素（HA)、神經(jīng)氨酸酶（NA)、核 衣殼蛋白（NP)和基質(zhì)蛋白2 (M2)的中和表位、Th表位、CTL表位以及B細(xì)胞表位作為疫苗 框架結(jié)構(gòu)，與禽細(xì)胞因子白介素18(chIL-18)基因串聯(lián)，在大腸桿菌中表達(dá)后，經(jīng)過(guò)蛋白純 化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組H9