一株表達(dá)植酸酶的釀酒酵母工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株釀酒酵母工程菌及其應(yīng)用，特別是一株在細(xì)胞表面錨定表達(dá)植酸酶的釀酒酵母菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]燃料酒精是一種可再生的清潔能源，國內(nèi)外生產(chǎn)燃料酒精的原料有玉米、甘薯、木薯、甘蔗、甜菜、高粱秸桿等，目前應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的主要是玉米類淀粉質(zhì)原料。酒精糟液的處理是燃料酒精生產(chǎn)中的一個關(guān)鍵工序，糟液中含有糖分，蛋白質(zhì)，纖維素，氨，磷，鉀等營養(yǎng)成分，經(jīng)濃縮處理后可用于生產(chǎn)動物飼料。酒精糟液中的磷主要以植酸磷的形式存在，植酸磷是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，不能被動物直接吸收利用，還會影響其他礦物元素的吸收，同時，植酸磷隨動物糞便排出體外后，會對環(huán)境造成污染。
[0003]植酸酶能夠催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)，同時釋放出與植酸(鹽)結(jié)合的其它營養(yǎng)物質(zhì)。在酒精發(fā)酵生產(chǎn)中，有通過外源添加植酸酶以提高酒精生產(chǎn)效率，降低酒糟中的植酸磷含量的研宄，但是要從根本上解決植酸磷酒精發(fā)酵及酒糟利用的不利影響，還是需要利用基因工程的手段構(gòu)建能夠分泌表達(dá)植酸酶的釀酒酵母菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一株表達(dá)植酸酶的釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy，已于2015年4月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)(武漢大學(xué)第一附小對面)武漢大學(xué)保藏中心，保藏編號CCTCC M 2015190。
[0005]本發(fā)明提供的釀酒酵母工程菌，是將植酸酶的編碼基因Phy和α -凝集素的編碼基因AG α I融合后導(dǎo)入釀酒酵母CICMY0086 (江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心保藏)中，得到的在細(xì)胞表面錨定表達(dá)植酸酶的菌株。
[0006]所述植酸酶的氨基酸序列的GenBank號為ΝΡ_415500 ;所述α -凝集素的GenBank號為 ΑΑΑ34417。
[0007]所述植酸酶的編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為946206 ;所述α -凝集素的編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為Μ28164。
[0008]所述植酸酶的編碼基因phy通過表達(dá)載體pMGK-AG導(dǎo)入釀酒酵母；所述表達(dá)載體PMGK-AG包含有α -凝集素編碼基因的核苷酸序列。
[0009]所述釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PHY0
[0010]釀酒酵母PHY由以下步驟獲得:
[0011](I)構(gòu)建重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy，流程如圖4所示。以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，PCR擴增得到植酸酶基因phy片段；將擴增得到的phy基因與質(zhì)粒pPIC9k連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-phy，以此為模板PCR擴增得到含信號肽的sphy基因，與表面展示載體pMGK-AG(江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心保藏)連接，得到重組載體pMGK-AG-phy。
[0012](2)將重組載體pMGK-AG-phy轉(zhuǎn)化釀酒酵母CICMY0086，獲得重組酵母PHY
[0013]釀酒酵母PHY的細(xì)胞為橢圓形，菌落形態(tài)特征是菌落凸起、光滑、乳白色、邊緣整齊；最適生長溫度30 °C，最適生長pH為5.5。
[0014]釀酒酵母PHY的植酸酶酶活為6.4U/g(菌體濕重)，酶活測定采用鉬藍(lán)法，具體操作:將800 μ L 6.25mmol/L的植酸鈉溶液37°C預(yù)熱lOmin，加入200 μ L上清液或全細(xì)胞催化劑，37°C反應(yīng)30min，立即加入ImL 5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，加入ImL顯色液(1.5%鉬酸銨溶液，2.7%硫酸亞鐵，4:1比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，室溫下靜置10min，8000r/min離心5min，測定其在700nm處的吸光值。酶活定義為:在37°C、pH 5.0條件下，每分鐘從5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放出I μπιο?的無機磷所需的酶量定義為I個酶活力單位。
[0015]本發(fā)明還提供了一種利用上述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)酒精的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明提供的生產(chǎn)酒精的應(yīng)用是以玉米粉/木薯培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，配制方法為:按l:3(w/v)的比例將玉米粉/木薯粉與去離子水混合，調(diào)pH至6.0，加入耐高溫α淀粉酶(10U/g)，加熱料液至95°C，維持2h，降至室溫后調(diào)pH至4.5，添加去離子水以彌補水分損失，高壓蒸汽滅菌，降溫后加入糖化酶(130U/g)和尿素(終濃度0.05% )。
[0017]本發(fā)明所提供的釀酒酵母工程菌，在以玉米粉/木薯粉為原料的同步糖化發(fā)酵實驗表明，生長速度高于出發(fā)菌株，同時酒精產(chǎn)量相較出發(fā)菌株提高了 5.6%。更為重要的是發(fā)酵后酒糟中植酸磷含量與對照相比降低了 91 %。構(gòu)建的表面展示表達(dá)植酸酶的重組工業(yè)釀酒酵母能夠有效降低植酸含量，提高了酒糟的利用價值，減少磷排放，對燃料酒精的環(huán)境友好生產(chǎn)具有重要的意義。
【附圖說明】
:
[0018]圖1為植酸酶基因PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒pPIC9k_phy酶切產(chǎn)物電泳圖
[0019]圖2為帶信號肽的植酸酶基因PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy酶切產(chǎn)物電泳圖
[0020]圖3為釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的染色體DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖[0021 ] 圖4為重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy的構(gòu)建流程圖
[0022]圖5為釀酒酵母工程菌PHY發(fā)酵過程中的葡萄糖和酒精變化圖
[0023]圖6為釀酒酵母工程菌PHY發(fā)酵的過程中，培養(yǎng)基干物質(zhì)中的植酸磷含量變化曲線
【具體實施方式】
:
[0024]下述實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0025]實施1、構(gòu)建釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)PHY。
[0026]一、含有植酸酶編碼基因的重組質(zhì)粒pPIC9K_phy的構(gòu)建
[0027]根據(jù)已報道的大腸桿菌植酸酶的編碼基因phy的核苷酸序列(phy基因序列的GenBank號為946206)，設(shè)計如下引物，在下游引物中引入EcoR I酶切位點(用下劃線標(biāo)出)。
[0028]上游引物Phyl:ATGAAAGCGATCTTAATCCCAT
[0029]下游引物Phy2: CCGGAATTCTTACAAACTGCACGCCGGTA
[0030]以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以Phyl、Phy2為引物，進(jìn)行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，得到一條約1300bp的特異性條帶，其大小與GenBank已公布的基因長度一致，經(jīng)進(jìn)一步DNA測序表明擴增得到植酸酶基因。將擴增得到的Phy基因用Pfu補平后與SnaB I酶切后的質(zhì)粒pPIC9k(江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心保藏)連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9k-phy。利用限制性內(nèi)切酶Sal I進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果見圖1，酶切得到大小約3000bp和7500bp的帶，與預(yù)期相當(dāng)，酶切驗證結(jié)果證明pPIC9k_phy的結(jié)構(gòu)正確。圖1中，泳道M為DL 15000DNA Marker，泳道I為Phy的PCR產(chǎn)物，泳道2為SnaB I酶切后的質(zhì)粒pPIC9k，泳道3為Sal I酶切后的重組質(zhì)粒pPIC9k_phy。
[0031]二、含有植酸酶編碼基因的重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy的構(gòu)建
[0032]根據(jù)pPIC9K中的alpha因子信號肽的核苷酸序列設(shè)計上游引物pl，引入EcoR I酶切位點，Pi核苷酸序列如下
[0033]上游引物P1: CCGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAA
[0034]以重組質(zhì)粒pPIC9k_phy為模板，以pl和Phy2為上下游引物，進(jìn)行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，得到一條約1500bp的特異性條帶，其大小與預(yù)期相同，表明擴增得到含信號肽植酸酶基因sphy。將PCR產(chǎn)物用EcoR I酶切后用核酸酶SI處理得到平末端片段，同樣方法處理表面展示載體pMGK-AG (江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心保藏)，T4連接酶16°C過夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體pMGK-AG-phy。利用限制性內(nèi)切酶Hind III進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果見圖2，酶切得到大小約1000bp、4000bp和6000bp的帶，與預(yù)期相當(dāng)，酶切驗證結(jié)果證明pMGK-AG-phy的結(jié)構(gòu)正確。圖2中，泳道M為DL 15000DNA Marker，泳道I為sphy的PCR產(chǎn)物，泳道2為EcoR I酶切后用核酸酶SI處理的質(zhì)粒pMGK-AG，泳道3為Hind III酶切后的重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy。
[0035]重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy的構(gòu)建流程如圖4所示。
[0036]三、重組質(zhì)粒pMGK-AG-phy轉(zhuǎn)化釀酒酵母CICMY0086
[0037]將重組質(zhì)粒pMGK-AG