桿菌的計 數(shù)。
【具體實施方式】
[0022] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0023] 除非特別說明，本發(fā)明實施例所用培養(yǎng)基和試驗條件為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基和試 驗。除非特別說明，本發(fā)明實施例所用試劑均為市購。
[0024] 實施例1乳酸菌菌毛蛋白亞基FimI基因的克隆、表達及純化
[0025] 載體 pET28a_SUMO 構(gòu)建：
[0026] 應(yīng)用引物 SUMO-f :5' -CGCGGATCCGAATGTCGGACTCAGAAGTCAA-3'（SEQ ID NO. 3) 和SUM0-r:5'-CCCAAGCTTGCACCACCAATCTGTTCTCTGT-3'（SEQIDN0·4)通過PCR從釀酒 酵母（S.cerevisiae)基因組中擴增出SUMO基因片段，用BamHI和HindIII雙酶切后，連 接到商業(yè)化質(zhì)粒載體pET28a(Novagen公司）BamHI/Hindlll位點，形成表達質(zhì)粒命名為 pET28a-SUM0。
[0027] 根據(jù)GenBank中登錄的干酪乳桿菌BL23菌毛亞基編碼序列設(shè)計一對含有HindIII 和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點的引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。用改良CTAB 法提取干酪乳桿菌BL23基因組DNA，應(yīng)用PCR方法擴增f iml基因 （SEQ ID NO. 1和No. 2)， 擴增產(chǎn)物大小為l〇〇5bp。PCR擴增產(chǎn)物純化回收后連入載體pGEM.?-T Easy (promega公司產(chǎn) 品）形成 pGEMT-fiml 質(zhì)粒。用 Hindlll+Xhol 分別雙酶切 pGEMT-fiml 質(zhì)粒和 pET28a-SUM0 載體質(zhì)粒，試劑盒回收目的片段，并將酶切回收的載體和FimI目的基因用T4DNA連接酶進 行連接，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細胞中，卡那霉素抗性篩選，挑取陽 性轉(zhuǎn)化子進行PCR和酶切鑒定。將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細 胞，用含有卡那霉素的LB平板篩選，獲得陽性克隆命名為E. coli BL21-fim I。將E. coli BL21-fim I接種于IOmL含卡那霉素（含lOOyg/mL卡那霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm培養(yǎng)過夜；次日按照2 %的接種量接入50mL TB培養(yǎng)液（含100 μ g/mL Kana)中， 37°C，200rpm培養(yǎng)至0D600值達到0· 6~0· 8,加入終濃度分別為0· lOmmol/L的IPTG，30°C， 200rpm培養(yǎng)5h，離心收集菌體沉淀加入等體積PBS重懸，超聲破碎細菌（300w工作2s，間歇 4s，400次），5000rpm離心10min，收集包涵體溶解后，通過Ni-NTA層析柱對重組蛋白進行 分離純化，收集重組蛋白。
[0028] PCR擴增結(jié)果顯示在1000 bp處出現(xiàn)特異性條帶，將目的基因與載體pET28a-SUM0 連接構(gòu)建原核表達載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，對陽性克隆進行PCR、限制性酶 切分析，結(jié)果顯示FimI目的基因已插入到表達載體中，序列測定所得拼接結(jié)果與已發(fā)表的 干酪乳桿菌群菌毛蛋白亞基FimI核苷酸序列99%相似。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，加入0. 04mmol/L IPTG、37°C誘導(dǎo)2h后蛋白表達量最高，并且以包涵體的形式 存在。包涵體蛋白用鹽酸胍溶解后過Ni-NTA層析柱純化，對咪唑洗脫緩沖液的穿透液進行 SDS-PAGE分析，但導(dǎo)入空載體的菌株其洗脫液中未出現(xiàn)目的條帶；導(dǎo)入重組載體的菌株在 200和250mmol/L咪唑洗脫液中出現(xiàn)重組蛋白，于45K~66. 2K之間有兩個分子量大小不同 的條帶。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，兩條蛋白均為干酪乳桿菌群菌毛蛋白亞基。
[0029] 實施例2重組FimI蛋白多克隆抗體的制備
[0030] 健康BALB/c小鼠在新環(huán)境下預(yù)養(yǎng)一周后進行眼眶采血，分離血清作為抗血清效 價檢測時的陰性對照。以濃度為0. lmg/mL的重組蛋白作為抗原，與等體積的弗氏完全佐劑 混合乳化，初次免疫劑量為0. 05mg/只，對實驗小鼠進行腹部皮下多點注射；2周后進行第1 次加強免疫（抗原量為初次免疫的1/2)，此后每隔1周加強免疫1次，共3次；最后一次加 強免疫完成5d后，對實驗小鼠進行眼球取血。將收集的血液于4°C放置2h，以3000rpm的 轉(zhuǎn)速離心10min，收集抗血清，-20°C保存。結(jié)果獲得了干酪乳桿菌群菌毛蛋白亞基FimI的 抗血清，血清效價高于1 :25600,血清能夠與干酪乳桿菌群菌株的可溶性蛋白反應(yīng)，但只能 與鼠李糖乳桿菌的全細胞反應(yīng)，與不同種屬的其他菌株無交叉反應(yīng)。
[0031] 實施例3全菌斑點免疫印跡法檢測鼠李糖乳桿菌
[0032] 將乳酸菌接種至MRS肉湯，37°C厭氧培養(yǎng)36h，4000rpm離心10min收集菌體，用 無菌生理鹽水洗滌2次，PBS重懸菌體，調(diào)整菌體濃度為0D_= 1. 0。以適當(dāng)濃度的菌懸液 點樣于硝酸纖維素膜上，用PBST將抗血清稀釋為1:250、1:500、1:1000、1:2000。37°C干燥 15min ;加入5%的脫脂乳，室溫封閉Ih ;取出后用PBST洗滌3次，加入適當(dāng)稀釋度的抗血 清，室溫孵育Ih ;洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG (1:1000稀釋），孵育Ih ;洗滌3次， 將膜浸入到新配制的DAB顯色液中，避光顯色lOmin，用去離子水漂洗2次終止反應(yīng)。
[0033] 結(jié)果如圖1。圖1中A、B、C、D分別使用1:250、1:500、1:1000、1:2000稀釋的抗 血清；編號1-16依次為純化重組蛋白、類布氏乳桿菌、戊糖片球菌、植物乳桿菌、食品乳桿 菌、戊糖乳桿菌、腸膜明串珠菌、棒狀乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、香腸 乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、融合乳桿菌、乳酸乳球菌、PBS。A抗血清稀釋度為1:250,棒狀乳桿 菌、發(fā)酵乳桿菌能顯現(xiàn)出清晰的灰色斑點，干酪乳桿菌有微弱的斑點印跡，隨著抗血清稀釋 度增加斑點顏色逐漸變淺；C抗血清稀釋度為1:1000時，這3種乳酸菌均未顯現(xiàn)出清晰斑 點；在4種不同稀釋度的抗血清作用下，鼠李糖乳桿菌均能顯現(xiàn)出清晰的黑色斑點，因此 1:1000抗血清稀釋度作為最佳工作濃度。
[0034] 實施例4菌落斑點免疫印跡法快速定量檢測樣品中的鼠李糖乳桿菌
[0035] 將鼠李糖乳桿菌及其它乳酸菌的混合物用生理鹽水梯度稀釋，分別涂布MRS平 板，37°C厭氧培養(yǎng)36h。剪取與培養(yǎng)皿內(nèi)徑大小相同的硝酸纖維素膜，于去離子中浸泡 lOmin，37°C干燥lOmin，將干燥后的硝酸纖維素膜放置于培養(yǎng)基表面，使膜與培養(yǎng)基表面菌 體充分接觸，靜置5min取膜，37°C干燥30min，以1:1000的FimI抗血清進行原位斑點免疫 印跡，
[0036] 結(jié)果如圖2。圖中A為涂布鼠李糖乳桿菌的MRS平板及其A2為原位斑點免疫印跡 試驗顯色后的硝酸纖維素膜，膜上顯現(xiàn)出清晰的小黑點，與MRS平板上的菌落一一對應(yīng)，表 明MRS上的鼠李糖乳桿菌菌落可以100%產(chǎn)生陽性信號，B為干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌混 合物及其轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，未出現(xiàn)陽性信號；C為15種乳酸菌混合物及其轉(zhuǎn)印硝酸纖維 素膜，未出現(xiàn)陽性信號；D為鼠李糖乳桿菌的混合物，結(jié)果其中的鼠李糖乳桿菌在轉(zhuǎn)印硝酸 纖維素膜上產(chǎn)生陽性信號。7個陽性菌落挑取后進行16S rDNA測序鑒定，結(jié)果均為鼠李糖 乳桿菌。與其他方法相比，具有較高的敏感性和重復(fù)性，操作方便廉價。
【主權(quán)項】
1. 干酪乳桿菌群菌毛亞基FimI在活性鼠李糖乳桿菌快速分離與計數(shù)中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得干酪乳桿菌群的 菌毛亞基FimI，重組FimI用鎳柱純化后免疫小鼠獲得多克隆抗體；將含有鼠李糖乳桿菌樣 品按常規(guī)處理后進行MRS平板涂布，37°C厭氧培養(yǎng)36h ;以硝化纖維膜為固相載體進行菌落 轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印膜通過干燥固定、脫脂乳封閉、洗滌、加抗體孵育后用DAB顯色；根據(jù)膜上出現(xiàn)明 顯斑點對樣品中的活性鼠李糖乳桿菌進行計數(shù)，同時通過斑點位置實現(xiàn)鼠李糖乳桿菌快速 分咼。
3. -種益生菌產(chǎn)品中活性鼠李糖乳桿菌快速分離與計數(shù)方法，其步驟包括： 1) 干酪乳桿菌群特異性菌毛亞基FimI為靶抗原制備多克隆抗體；作為鼠李糖乳桿菌 檢測抗體； 2) 利用檢測抗體采用菌落免疫印跡法檢測和定量樣品中中的鼠李糖乳桿菌； 3) 菌落免疫印跡結(jié)合MRS平板計數(shù)對樣品中鼠李糖乳桿菌進行定量檢測。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種方法，其特征在于步驟2)中，以硝酸纖維素膜為固相載 體，菌落細胞作為固相抗原進行斑點免疫印跡分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中，MRS平板計數(shù)與菌落斑點免疫 印跡結(jié)合，定量檢測樣品中的鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種益生菌產(chǎn)品中活性鼠李糖乳桿菌快速分離與計數(shù)方法；公開了干酪乳桿菌群菌毛亞基FimI在活性鼠李糖乳桿菌快速分離與計數(shù)中的應(yīng)用。具體是通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得干酪乳桿菌群的菌毛亞基FimI，重組FimI用鎳柱純化后免疫小鼠獲得多克隆抗體；將含有鼠李糖乳桿菌樣品按常規(guī)處理后進行MRS平板涂布，厭氧培養(yǎng)；以硝化纖維膜為固相載體進行菌落轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印膜通過干燥固定、脫脂乳封閉、洗滌、加抗體孵育后用DAB顯色；根據(jù)膜上出現(xiàn)的斑點對樣品中的活性鼠李糖乳桿菌進行計數(shù)，并通過斑點位置實現(xiàn)鼠李糖乳桿菌快速分離。本發(fā)明方法操作簡便有效，便于推廣使用，適合益生菌產(chǎn)品中鼠李糖乳桿菌的分離鑒定及其質(zhì)量評價使用。
【IPC分類】C12N1-20, G01N33-569, C12R1-225
【公開號】CN104805043
【申請?zhí)枴緾N201510204220
【發(fā)明人】楊振泉, 張咪, 高璐, 饒勝其, 尹永祺
【申請人】揚州大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月27日