誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域，尤其涉及誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞治療被認(rèn)為是臨床上一種組織損傷修復(fù)的安全、有效的治療方法。現(xiàn)有技 術(shù)中，以骨髓或臍血充間質(zhì)干細(xì)胞作為創(chuàng)面修復(fù)材料的技術(shù)已有報(bào)道。但是，骨髓充間質(zhì)干 細(xì)胞（BMSCs)存在病毒污染的隱患，且隨著供者年齡增長，其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力出 現(xiàn)明顯下降趨勢，不適合批量制備。而來源于臍血或胎盤的充間質(zhì)干細(xì)胞雖然可以克服上 述缺陷，卻僅能在出生時(shí)保存，并非所有患者都能提供。從人體脂肪組織中分離出來的脂肪 間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs)可通過分泌多種生長因子，控制和調(diào)節(jié)臨近的受損細(xì)胞，發(fā)揮重要 功能，而且ADSCs容易從吸脂的脂肪中獲得，對患者創(chuàng)傷小，干細(xì)胞分離效率高，具有多能 分化的能力，因此ADSCs近年來已經(jīng)成為種子細(xì)胞的研宄熱點(diǎn)。
[0003] 但是，將ADSCs用于制備創(chuàng)面修復(fù)材料首先面臨的問題就是分化。2008年有報(bào)道 稱，利用脂肪干細(xì)胞于人脫細(xì)胞真皮基質(zhì)復(fù)合，移植到裸鼠皮膚缺損處，發(fā)現(xiàn)植入的細(xì)胞向 血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞分化，并能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。而皮膚作為人體面積 最大的器官，發(fā)生大面積缺損或難愈合是現(xiàn)如今困擾臨床工作著的一大難題，ADSCs無疑成 為種子細(xì)胞和支架材料的理想選擇?，F(xiàn)有技術(shù)中對ADSCs成纖維細(xì)胞分化研宄較少，僅有 的研宄結(jié)果顯示，ADSCs分化為成纖維細(xì)胞所需的時(shí)間較為漫長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種快速誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成 纖維細(xì)胞的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞的方法為：將脂肪干細(xì)胞于磷酸 維生素 C和bFGF存在條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到成纖維細(xì)胞。
[0006] 磷酸維生素 C，又名維生素 C磷酸酯，能夠促進(jìn)膠原蛋白生成。
[0007] bFGF為成纖維細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)有絲分裂的作用，能夠促進(jìn)創(chuàng)傷組織愈合 與組織修復(fù)，促進(jìn)組織再生。
[0008] 本發(fā)明采用磷酸維生素 C和bFGF作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化成為成纖維細(xì) 胞。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過7~10天的誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化，且與其他對照組相比 分化速度更快。
[0009] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5wt% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0010] 在一些實(shí)施例中，bFGF的濃度為5~15 μ g/mL;磷酸維生素 C的濃度為0.5~ I.5mmol/L〇
[0011] 在一些實(shí)施例中，bFGF的濃度為10 μ g/mL ;磷酸維生素 C的濃度為lmmol/L。
[0012] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)表明，生長因子的種類、濃度對脂肪干細(xì)胞成纖維細(xì)胞分化速度 的影響十分顯著，改變生長因子的種類或濃度會(huì)導(dǎo)致分化速度的下降。
[0013] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還包括地塞米松。
[0014] 在一些實(shí)施例中，地塞米松的濃度為0. 01~0. 2 μ mol/L。
[0015] 在一些實(shí)施例中，地塞米松的濃度為0. 1 μ mol/L。
[0016] 地塞米松作為抗炎劑使用。
[0017] 在一些實(shí)施例中，脂肪干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)前，經(jīng)胰蛋白酶消化、融合。
[0018] 具體的，脂肪干細(xì)胞的胰蛋白酶消化、融合為：取第三代~第五代的脂肪干細(xì)胞， 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 25%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 02% EDTA進(jìn)行消化，以血清終止消化后 1200r/min離心5min，以DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為I X 104/mL，培養(yǎng)至40 %~ 50 %融合。
[0019] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中每2天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0020] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為7d~10d，溫度為37°0,〇)2體積分?jǐn)?shù)5%，飽 和濕度95%。
[0021] 在一些實(shí)施例中，第三代~第五代的脂肪干細(xì)胞的制備方法包括：將脂肪組織經(jīng) PBS緩沖液沖洗，以膠原酶消化后，經(jīng)離心取細(xì)胞沉淀后以脂肪干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至 80%融合，以胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)至第三代~第五代。
[0022] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，還包括擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代的步驟。
[0023] 在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代的培養(yǎng)基為成纖維細(xì)胞無血清培養(yǎng)基SFM。
[0024] 在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代過程中，每2天更換培養(yǎng)基。
[0025] 在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代的條件為溫度為37°C，0)2體積分?jǐn)?shù)5%，飽和濕 度 95%。
[0026] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞的方法為：將脂肪干細(xì)胞于磷酸 維生素 C和bFGF存在條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到成纖維細(xì)胞。經(jīng)試驗(yàn)證明，采用本發(fā)明提供的 方法，培養(yǎng)7~10天后細(xì)胞仍呈梭形或漩渦形狀，雖然形狀上與脂肪干細(xì)胞十分相似，但是 對I型膠原的表達(dá)情況檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)后的細(xì)胞中I型膠原的表達(dá)量升高了 124倍，顯 著優(yōu)于對照組。說明，采用本發(fā)明提供的方法成功將脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化稱為成纖維細(xì)胞， 且分化速度優(yōu)于對照組。繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代過程中，細(xì)胞進(jìn)一步的分化、擴(kuò)增，從而能夠獲 得更大量的成纖維細(xì)胞。
【附圖說明】
[0027] 圖1示原代培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的倒置顯微鏡（100X)觀察結(jié)果，其中，圖ι-a示原代 培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果；圖Ι-b示原代培養(yǎng)5天后觀察結(jié)果；
[0028] 圖2示流式細(xì)胞儀檢測擴(kuò)增培養(yǎng)至第三代的脂肪干細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況；
[0029] 圖3示脂肪干細(xì)胞成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后以倒置顯微鏡放大40倍觀察細(xì)胞形態(tài) 結(jié)果；其中圖3-a示誘導(dǎo)培養(yǎng)前脂肪干細(xì)胞形態(tài)，圖3-b示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)；圖 3-c示對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)；圖3-d示對照組2細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)；圖3-e示對 照組3細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)；
[0030] 圖4示免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)分化后細(xì)胞I型膠原的表達(dá)情況；其中，圖4-a示實(shí) 驗(yàn)組細(xì)胞I型膠原表達(dá)情況；圖4-b示對照組1細(xì)胞I型膠原表達(dá)情況；圖4-c示對照組2 細(xì)胞I型膠原表達(dá)情況；圖4-d示對照組3細(xì)胞I型膠原表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明提供了誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借 鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過 較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的方 法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0032] 本發(fā)明