一種草莓基因組dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種草莓基因組DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草莓是一種薔薇科多年生草本植物，一年可以多次開花結(jié)果，是我國冬季重要的一種時令水果。草莓葉片和果實中含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、酚酸、維生素等次生物，這讓它具有了較高的利用價值，但同時給其基因組DNA的提取也帶來了較大的困難。因為這些粘性極強的次生物會與DNA共沉淀或者捆綁在一起，嚴重影響了 DNA質(zhì)量，導致后續(xù)的擴增、酶切等分子生物學難以進行。
[0003]高質(zhì)量基因組DNA的提取分離是分子生物學研宄的基礎(chǔ)，常用的基因組DNA最基本的提取方法有:CTAB法和SDS法，其它如試劑盒法、高鹽法等都是在這2種方法的基礎(chǔ)上進行的改良或簡化。這幾種方法對極細嫩的組織會有效，但對于老葉片，果實，往往最后得到的DNA樣品非常粘稠，提取的DNA樣品由于含有大量的次生物不易溶于TE緩沖液，纏攪在其中的粘性物致使DNA檢測時上樣困難、電泳困難。凝膠電泳檢測顯示DNA得率很低，上樣孔或樣道非常亮(見圖1?2)。因此，開發(fā)一種適合草莓DNA提取的方法，能大大方便地進行分子生物學操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有中的缺點，公開了一種草莓基因組DNA的提取方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決。
[0006]一種草莓基因組DNA的提取方法，包括以下步驟，
[0007](I)將CTAB提取液預熱到55?65°C，每Ig草莓果實或葉片粉末中加入5?1ml預熱后的CTAB提取液，在55?65°C下保溫30?60分鐘，其間晃動3?4次使其混合，得到混合物I ;在粉末中加入預熱過的CTAB提取液，在60?65°C下保溫30?60分鐘，晃動3?4次，使其充分混合。
[0008](2)將步驟⑴中的混合物I中加入5M的醋酸鉀溶液，加入醋酸鉀溶液的體積為步驟(I)中CTAB提取液體積的1/4?1/3，冰浴條件下放置l_2h，得到混合物II ;
[0009](3)再加入氯仿/異戊醇混合液，加入的氯仿/異戊醇混合液與混合物II等體積；混合后在2-5°C離心，收集上清液；在上清液中加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇混合液，在2-5°C離心；重復步驟(3)中操作，直至上清液中無雜質(zhì)為止，得到中間相I ;
[0010](4)向步驟(3)所得的中間相I中加入異丙醇，加入異丙醇的體積為中間相I體積的2/3，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心得到沉淀物；
[0011](5)向步驟(4)中得到的沉淀物中加入含40?100 μ g/ml核糖核酸酶的TE緩沖液，然后在37°C的水浴中反應30?60min，得到混合物II ；
[0012](6)向混合物II中加入混合物II等體積的氯仿/異戊醇混合液，在2-5°C離心，取上清液；向上清液中加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇混合液，在2-5°C離心，重復步驟(6)中操作，直至上清液中中無雜質(zhì)為止，得到中間相II ;
[0013](7)取步驟(6)所得的中間相II，加入3M醋酸鈉和乙醇，加入醋酸鈉的體積為中間相II體積的1/10，加入乙醇的體積為中間相II體積的2倍；_20°C放置30?60min，然后在2-5°C離心，收集沉淀物；
[0014](8)向步驟(7)所得的沉淀物中加入TE緩沖液，溶解后即得草莓基因組DNA。
[0015]作為優(yōu)選，步驟(I)中，CTAB提取液包括，1-3 % (m/V)的CTAB，80-120mM的Tris-HCl, 10-25mM 的 EDTA, 1-2M 的 NaCl 和 1-3% 的 PVP ；CTAB 提取液的 pH 值為 7.5-8.5。
[0016]作為優(yōu)選，CTAB提取液包括，2% (m/V)的 CTAB，10mM 的 Tris-HCl，20mM 的 EDTA，1.4M的NaCl和2%的PVP ；CTAB提取液的pH值為8.0。
[0017]作為優(yōu)選，將CTAB提取液在110-120 °C滅菌20_40min，使用時在每10mlCTAB提取液中加入l_3ml的β -巰基乙醇。
[0018]作為優(yōu)選，步驟(7)中，乙醇為無水乙醇。
[0019]作為優(yōu)選，氯仿/異戊醇混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0020]作為優(yōu)選，離心時，轉(zhuǎn)速控制在10000?12000rpm，離心10?15分鐘。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明綜合了 CTAB法和SDS提取方法的特點，利用CTAB的高裂解力和去除多糖的效果，加上SDS法提取DNA中的，高鹽濃度(醋酸鉀)和降低溫度(冰上保溫)的辦法沉淀除去蛋白質(zhì)和多糖(在低溫條件下醋酸鉀與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物)，離心除去沉淀后，上清液中的DNA用氯仿/異戊醇抽提，反復抽提后用異丙醇沉淀，再用Rnase去除RNA后用氯仿/異戊醇抽提，再用乙醇沉淀水相中的DNA，得到高質(zhì)量的與雜質(zhì)徹底分離的草莓基因組DNA。經(jīng)檢測用本發(fā)明方法得到的草莓基因組DNA質(zhì)量較高；用該草莓基因組DNA進行PCR擴增，得到較好的擴增結(jié)果。進而，本發(fā)明解決了草莓次生物含量高導致的高質(zhì)量DNA提取困難的問題。
【附圖說明】
[0022]圖1是傳統(tǒng)CTAB法提取的草莓DNA凝膠電泳檢測圖片。
[0023]圖2是傳統(tǒng)SDS法提取的草莓DNA凝膠電泳檢測圖片。
[0024]圖3是本發(fā)明方法提取的草莓DNA凝膠電泳檢測圖片。
[0025]圖4是本發(fā)明方法提取的DNA的檢測草莓鑲脈病毒的凝膠電泳檢測圖片。
[0026]圖5是本發(fā)明、傳統(tǒng)CTAB法、傳統(tǒng)SDS法提取的草莓DNA凝膠電泳檢測結(jié)果對比圖。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]一種草莓基因組DNA的提取方法，CTAB提取液包括，I % (m/V)的CTAB，80mM的Tris-HCl，1mM 的 EDTA，IM 的 NaCl 和 I % 的 PVP ；CTAB 提取液的 pH 值為 7.5。將 CTAB 提取液在110°C滅菌20min，使用時在每100ml CTAB提取液中加入Iml的β -巰基乙醇。所使用的氯仿/異戊醇混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0029]包括以下步驟，
[0030](I)將CTAB提取液預熱到55°C，每Ig草莓果實或葉片粉末中加入5ml預熱后的CTAB提取液，在55°C下保溫30分鐘，其間晃動3次使其混合，得到混合物I ;
[0031](2)將步驟(I)中的混合物I中加入5M的醋酸鉀溶液，加入醋酸鉀溶液的體積為步驟(I)中CTAB提取液體積的1/4，冰浴條件下放置lh，得到混合物II ;
[0032](3)再加入氯仿/異戊醇混合液，加入的氯仿/異戊醇混合液與混合物II等體積；混合后在2°C離心，收集上清液；在上清液中加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇混合液，在2°C離心；重復步驟(3)中操作，直至上清液中無雜質(zhì)為止，得到中間相I ;
[0033](4)向步驟(3)所得的中間相I中加入異丙醇，加入異丙醇的體積為中間相I體積的2/3，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心得到沉淀物；
[0034](5)向步驟(4)中得到的沉淀物中加入含40 μ g/ml核糖核酸酶的TE緩沖液，然后在37°C的水浴中反應30min，得到混合物II ；
[0035](6)向混合物II中加入混合物II等體積的氯仿/異戊醇混合液，在2°C離心，取上清液；向上清液中加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇混合液，在2°C離心，重復步驟(6)中操作，直至上清液中中無雜質(zhì)為止，得到中間相II ;
[0036](7)取步驟(6)所得的中間相II，加入3M醋酸鈉和乙醇，加入醋酸鈉的體積為中間相II體積的1/10，加入乙醇的體積為中間相II體積的2倍；-20°C放置30min，然后在2°C離心，收集沉淀物；
[0037](8)向步驟(7)所得的沉淀物中加入TE緩沖液，溶解后即得草莓基因組DNA。
[0038]圖1和圖2分別是傳統(tǒng)CTAB和SDS法提取草莓DNA的方法，從圖1、圖2中可以看出，這兩種方法提取的DNA帶型彌散、降解嚴重；由于多糖等物質(zhì)含量豐富，導致點樣孔比較亮，DNA無法迀移，0D260/280值在I左右；在用TE溶解時，混合溶液黏稠，用移液槍精確移取困難，當用大量TE溶解后，導致濃度過低，一般無法滿足酶切需求。圖3是用本專利方法提取的草莓DNA，從圖中可以看出，所提取的草莓DNA帶型整齊，點樣孔干凈，0D260/280比值在1.8附近。用本方法提取達賽拉克草莓葉片DNA后，檢測了草莓鑲脈病毒的情況，從圖4電泳結(jié)果可以看出，PCR電泳好，點樣孔也干凈，是一種比較理想的提取草莓DNA的方法。
[0039]由此可見，本發(fā)明方法得到的草莓基因組DNA質(zhì)量較高；用該草莓基因組DNA進行PCR擴增，得到較好的擴增結(jié)果。
[0040]實施例2
[0041 ] 一種草莓基因組DNA的提取方法，所使用的CTAB提取液包括，3%