一種用于病毒基因組核酸提取試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從臨床標(biāo)本中提取病毒基因組核酸試劑盒及其利用本發(fā)明試劑 盒從臨床標(biāo)本中提取病毒基因組核酸的方法。本發(fā)明試劑盒可用于血漿、血清、淋巴液、 脫落細(xì)胞、唾液、尿液、糞便和培養(yǎng)細(xì)胞上清液等，高效率提取獲得病毒基因組核酸，可用于 PCR擴(kuò)增、篩查突變、基因分型、基因測(cè)序和樣本儲(chǔ)存等科研或臨床診斷分析。
【背景技術(shù)】
[0002] 完整的病毒顆粒包括外殼蛋白和內(nèi)部的基因組DNA或RNA，每種病毒顆粒中只含 有一種核酸，或?yàn)镈NA或?yàn)镽NA。病毒必須借助宿主細(xì)胞，利用宿主的復(fù)制系統(tǒng)，按照病毒基 因的指令復(fù)制新的病毒而繁殖。
[0003] 研宄發(fā)現(xiàn)大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒有一特殊的致癌基因，可使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。如大 約70%的宮頸癌病例與HPV-16和HPV-18這兩種病毒有關(guān)；Epstein-Barr (EB)病毒與鼻咽 癌、幽門螺桿菌與胃癌、乙型和丙肝肝炎病毒與肝癌、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒1型與白血病 以及艾滋病病毒與卡波西肉瘤等均有著十分密切的關(guān)系。病毒基因組核酸編碼了所有的病 毒生命信息，從基因水平分析可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷病毒的發(fā)生，為臨床早治療提供保證，防 止癌癥的發(fā)生。因而，獲取病毒基因組核酸是科研和臨床檢測(cè)的關(guān)鍵，高效率提取病毒基因 組核酸就尤為重要了。
[0004] 目前臨床常用的病毒基因組核酸提取方法有酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酞胺 裂解法，能夠滿足各種試驗(yàn)的要求，但操作繁瑣，用時(shí)長(zhǎng)，且所用試劑具有一定的毒性；玻璃 顆粒吸附法對(duì)DNA提取效果較好，但對(duì)RNA吸附能力一般，無(wú)法滿足提RNA病毒的要求。
[0005] 目前市場(chǎng)常用的病毒基因組核酸提取試劑盒產(chǎn)品分別是針對(duì)DNA和RNA提取的， 很少將DNA和RNA同時(shí)提取進(jìn)行下一步科研或臨床檢測(cè)需要。病毒基因組核酸采用磁珠或 硅基磁珠法利用特異性吸附DNA和RNA能力，通過(guò)漂洗取出蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，后用低鹽溶 液洗脫得到基因組DNA，操作中未用到酚、氯仿等有機(jī)溶劑以及強(qiáng)堿，但用磁珠或硅基磁珠 對(duì)DNA和RNA吸附能力不足，獲取的DNA和RNA濃度不高。
[0006] 本發(fā)明利用能快速提取病毒基因組核酸的硅基磁珠法，不使用有機(jī)溶劑或強(qiáng)堿的 同時(shí)，還能快速獲取高濃度的DNA和RNA，以備下一步科研或臨床檢測(cè)足夠使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種從臨床標(biāo)本高效地提取病毒基因組核酸的試劑盒及其從提取病 毒基因組核酸的方法，血漿、血清、淋巴液、脫落細(xì)胞、唾液、尿液、糞便和培養(yǎng)細(xì)胞上清液 等，提取得到高濃度的病毒基因組核酸可用于科研或臨床檢測(cè)之用。
[0008] 本發(fā)明是發(fā)明人多年來(lái)對(duì)上萬(wàn)例臨床標(biāo)本的提取病毒基因組核酸工作經(jīng)驗(yàn)和技 術(shù)改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)在含有硫氰酸胍在PH值為5. 5時(shí)使得硅基修飾磁珠發(fā)揮更大吸附核酸能力， 每1克硅基修飾磁珠吸附核酸達(dá)到IOmg以上，包括DNA和RNA ;另外還發(fā)現(xiàn)十六烷基三 甲基溴化按（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)是一種陽(yáng)離子去污劑，具在 高離子強(qiáng)度的溶液中（>〇. 7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不 能沉淀核酸，可以去除標(biāo)本中絕大數(shù)的蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)；以及加入聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrrolidone，PVP)K25能與多酷形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酷，減 少核酸中酚的污染，去除溶液中色素，同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。
[0009] 本發(fā)明在一個(gè)提取緩沖液1中一次性完成對(duì)標(biāo)本的細(xì)胞裂解和DNA釋放；蛋白、糖 類和酚類等雜質(zhì)的去除；硅基修飾磁珠吸附核酸等一系列過(guò)程。同時(shí)本發(fā)明采用磁力架配 合硅基修飾磁珠使用，在臨床檢測(cè)中可以建立一個(gè)核酸提取平臺(tái)，只需在磁力架上吸附磁 珠并用乙醇洗滌以及無(wú) RNA酶水洗脫，即可獲得高濃度病毒基因組核酸。因而，建立起的這 一平臺(tái)，將方便快捷的獲取臨床標(biāo)本中核酸，以便進(jìn)一步PCR擴(kuò)增或基因檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明所提供的一種用于提取病毒基因組核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒由蛋白酶K、硅基修飾磁珠、提取緩沖液、漂洗液I、漂洗液II及無(wú) RNA酶水組成，并配套 含有磁力架；其中，優(yōu)選，所述提取緩沖液由硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化銨、聚乙烯吡咯 烷酮K25、Tris-HCl、EDTA以及NaCl組成；優(yōu)選，所述提取病毒基因組核酸，經(jīng)超微量分光 光度計(jì)檢測(cè)，其A260/A280比值大于I. 8 ;A260/A230的比值大于2. 0 ;超微量分光光度計(jì)檢 測(cè)50 μ 1脫落細(xì)胞液提取的核酸效率達(dá)到50 μ g/ml以上。 toon] 本發(fā)明所提供的一種病毒基因組核酸提取試劑盒，優(yōu)選各組成分別為：
[0012] 1)蛋白酶 K :為 10-100mg/ml 蛋白酶 K，Iml/ 支；
[0013] 2)娃基修飾微球G :l-100mg/ml，1 μπι娃基修飾微球，Iml/支；
[0014] 3)提取緩沖液1(1-20Μ硫氰酸胍，1-5 % %十六烷基三甲基溴化銨（質(zhì)量體 積比），〇· 5-5 %聚乙烯吡咯烷酮Κ25 (質(zhì)量體積比），IOOmM Tris-HCl (pH5. 5)，25mM EDTA (ρΗ5· 5)，2. OM NaCl)，20ml/ 瓶；
[0015] 4)漂洗液 I :70% 乙醇，30ml/ 瓶；
[0016] 5)漂洗液 II :96% 乙醇，60ml/ 瓶；
[0017] 6) RNase-Free 去離子 H2O :電阻率大于 18M Ω *cm，IOml/ 瓶。
[0018] 上述病毒基因組核酸提取試劑盒并配置1個(gè)磁力架，可用于樣本的50次病毒基因 組核酸提取，并可組成100次、200次和500次等病毒基因組核酸提取試劑盒，含使用說(shuō)明書(shū) 一份，試劑盒保存在4°C冰箱，有限期為1年。
[0019] 所述病毒基因組核酸提取試劑盒中提取緩沖液1，優(yōu)選地為含有1-20M硫氰酸胍， 更優(yōu)選地含有4M硫氰酸胍。
[0020] 所述病毒基因組核酸提取試劑盒中提取緩沖液1，優(yōu)選地為含有2%十六烷基三 甲基溴化銨和2%聚乙烯吡咯烷酮K25。
[0021] 本發(fā)明所提供的病毒提取基因組核酸的方法，其特征在于包括以下步驟：
[0022] 1)取1個(gè)I. 5ml無(wú)核酸酶的離心管，加入20 μ 1蛋白酶K和15 μ 1磁珠懸浮液G， 再加入300 μ 1提取緩沖液1。
[0023] 2)加入200 μ 1血漿/血清/淋巴液/脫落細(xì)胞上清，用移液器吹吸或渦旋振蕩混 勻；56°C孵育lOmin，期間每3min用移液器吹吸或上下顛倒混勻lOsec，使磁珠和核酸充分 結(jié)合。
[0024] 3)將離心管置于磁力架上lmin，待磁珠完全吸附時(shí)用移液器小心去除液體；將離 心管從磁力架上取下，加入500 μ 1漂洗液I，渦旋混勻lmin。
[0025] 4)將離心管放置于磁力架上靜置30sec，待磁珠完全吸附時(shí)小心去除液體；將離 心管從磁力架上取下，加入500 μ 1漂洗液II，渦旋混勻lmin。將離心管放置于磁力架上靜 置30sec，待磁珠完全吸附時(shí)小心去除液體；
[0026] 5)重復(fù)步驟3、4,液體盡量去除干凈；離心管于磁力架上，室溫晾干5-10min。將 離心管從磁力架上取下，加入50μ1 RNase-free ddH20,禍旋混勾；
[0027] 6)將離心管放置于磁力架上靜置2min，待磁珠完全吸附時(shí)小心將核酸溶液轉(zhuǎn)移 至新的離心管中，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 本發(fā)明提供的用于病毒基因組核酸提取試劑盒及其方法不限于人類標(biāo)本，還可以 用于哺乳動(dòng)物、禽類、兩棲類動(dòng)物等；需要的標(biāo)本量非常低，均可提取得到高濃度的基因組 核酸。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的用于病毒基因組核酸提取試劑盒及其方法還可以用于脫落細(xì) 胞，包括鼻咽部、口腔、食管、胃粘膜、陰道、胸膜腔、腹膜腔、心包腔積液和腦脊髓膜腔積液 等脫落細(xì)胞。
[0029] 通過(guò)本發(fā)明所述的試劑盒及其方法得到的高濃度基因組核酸，其特征在于經(jīng)過(guò)超 微量分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值大于1. 8,表明無(wú)蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的 比值大于2. 0,表明無(wú)碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染；超微量分光光度計(jì)檢測(cè) 50ul 口腔脫落細(xì)胞液提取的核酸效率可達(dá)到50 μ g/ml以上；滿足所有基因研