利用家蠶細(xì)胞表達(dá)抗菌肽apidaecin和制備抗菌肽apidaecin的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種利用家蠶細(xì)胞表達(dá)抗菌肽apidaecin和 制備抗菌肽apidaecin的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽是由生物體基因之間編碼產(chǎn)生的一類能抵抗外界病原體感染的小分子肽， 具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、無免疫原性、抗菌譜廣等特性，其抗菌活性和抗菌效應(yīng)與抗生素非常接 近，在替代抗生素方面顯示了巨大的潛力。apidaecin是一類富含脯氨酸的抗菌肽，由于其 獨特的抑菌作用機制而備受關(guān)注，研究表明，apidaecin能特異地作用于革蘭氏陰性菌，對 大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和乙酸鈣不動桿菌等致病菌均具有普遍的殺傷作用。因 此，apidaecin對解決因革蘭氏陰性菌而導(dǎo)致的抗生素抗性危害不斷加重的問題具有特殊 意義。
[0003] 目前，抗菌肽可通過以下途徑獲得：1、從生物體提取純化；2、化學(xué)合成；3、基因工 程，其中前兩種方法由于成本和技術(shù)問題，不適于抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)，基因工程方法是目 前最有潛力的途徑。Apidaecin已在多種不同的宿主中表達(dá)，如鏈霉菌、乳酸乳球菌等，這些 制備apidaecin的方法普遍存在著表達(dá)量低、成本昂貴，無法達(dá)到實際應(yīng)用的要求等問題。
[0004] 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)自建立之后，就得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。與其他表達(dá) 系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有以下特點：安全性好，表達(dá)產(chǎn)物后加工比較完全，可容納 較大的DNA片段，適合表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白，最大的特點是外源蛋白表達(dá)量高，若以家蠶幼蟲 或蛹做為生物反應(yīng)器，還有下列優(yōu)點：
[0005] (1)蠶體中有多種天然蛋白保護劑，對表達(dá)產(chǎn)物有保護作用，與昆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 相比，家蠶體內(nèi)表達(dá)水平往往高出100-1000倍。
[0006] (2)家蠶遺傳背景清楚，且飼養(yǎng)的成本低，桑葉飼養(yǎng)的家蠶僅0. 5元/條，用家蠶生 成外源蛋白容易產(chǎn)業(yè)化。
[0007] (3)利用家蠶作為生物反應(yīng)器，具有我國資源優(yōu)勢和特色，容易形成自主產(chǎn)業(yè)。
[0008] (4)由于蠶蛹本身可以食用，所以家蠶作為生物反應(yīng)器有望開拓新的應(yīng)用領(lǐng) 域，如口服藥物，口服疫苗等，張耀洲等發(fā)現(xiàn)含有重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)的蠶蛹經(jīng)離心、脫脂、純化、凍干之后，經(jīng)劑型加工制成口服藥。該藥給藥于白細(xì)胞 缺少的動物模型或因化療等原因造成的白細(xì)胞減少病人，有很強的生白效果，這些凍干蠶 蛹蛋白質(zhì)在對小鼠和獼猴的長短期毒理安全性試驗中均未發(fā)現(xiàn)異常。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用桿狀病 毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶細(xì)胞內(nèi)安全、高效地表達(dá)抗菌肽apidaecin的方法。
[0010] 本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)量高的抗菌肽apidaecin的制 備方法。 toon] 本發(fā)明解決第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種利用家蠶細(xì)胞表達(dá)抗菌肽 apidaecin的方法，其特征在于包括以下步驟：
[0012] (1)化學(xué)合成如SEQ ID NO. 1所述的AP2基因，并在該AP2基因的5'端加上腸激 酶酶切位點序列，并克隆入pFastBacHta，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFast_His_AP2,該質(zhì)粒表達(dá)His融 合的AP2 ;
[0013] (2)將步驟（1)所得的重組質(zhì)粒pFast-His-AP2轉(zhuǎn)化BmDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞；
[0014] (3)經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取含有重組Bacmid的白色菌落，抽提重組BmBacmid基因；
[0015] (4)將步驟（3)所得的重組BmBacmid基因轉(zhuǎn)染BmN培養(yǎng)細(xì)胞并進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過 程中當(dāng)觀察到細(xì)胞感染時，將BmN培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液離心收集感染上清，得到重組病毒；
[0016] (5)將步驟（4)所得的重組病毒上清繼續(xù)感染BmN培養(yǎng)細(xì)胞，感染72小時候，分別 收集感染BmN培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)上清，將收集到的感染BmN培養(yǎng)細(xì)胞懸浮于昆蟲細(xì)胞裂解液， 冰上超聲裂解，離心取上清得表達(dá)產(chǎn)物，該表達(dá)產(chǎn)物為帶His融合的AP2融合蛋白。
[0017] 上述方案中，藍(lán)白斑篩選使用的培養(yǎng)基為含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素的固體培 養(yǎng)基。
[0018] 本發(fā)明解決第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：將按第一個技術(shù)方案所述的利 用家蠶細(xì)胞表達(dá)抗菌肽apidaecin的方法制得的帶His的AP2融合蛋白用His親和層析進 行洗脫純化，洗脫液在腸激酶酶解緩沖液中透析過夜后，用5kDa的過濾膜濃縮，所得濃縮 液中加入EK后再25°C酶切過夜，酶切溶液即為AP2的粗制品。
[0019] 洗脫純化過程中，在漂洗緩沖液中依次加入5mM、IOmM和20mM的咪唑，使得洗脫液 中咪唑的終濃度為400mM，層析過程中加入競爭性咪唑緩沖液可有效減少非特異性結(jié)合，提 高層析產(chǎn)物純度。
[0020] 上述方案中在純化和濃縮所述AP2的粗制品的每一步中均加入終濃度為0. 5mM的 PMSF，可有效防止蛋白質(zhì)制品在純化過程中降解。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶BmN培養(yǎng)細(xì) 胞表達(dá)抗菌肽apidaecin可有效增加表達(dá)產(chǎn)量，同時家蠶細(xì)胞中有多種天然蛋白質(zhì)保護 齊?，可對表達(dá)產(chǎn)物進行有效表達(dá)，使得基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定，提高表達(dá)安全性。
【附圖說明】
[0022] 圖1為實施例1中大腸桿菌BmDHlOBac細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)座示意圖；
[0023] 圖2為實施例1中PCR方法確認(rèn)轉(zhuǎn)座發(fā)生的原理示意圖；
[0024] 圖3為實施例3中重組蛋白酶切處理效果示意圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
[0026] 材料：
[0027] BmNPV Bac-to-Bac快速表達(dá)系統(tǒng)由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院吳小鋒教授研究室開 發(fā)并保存，主要包括已被轉(zhuǎn)化BmNPV Bacmid和輔組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞BmDHIOBac、供體質(zhì) 粒 pFastBacHTa, b, c 等；
[0028] AP2基因片段由上海生工生物工程有限公司合成并克隆入pFastHta ;
[0029] 家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN細(xì)胞由吳教授研究室保存；
[0030] 培養(yǎng)家蠶培BmN細(xì)胞培養(yǎng)基為TC-100，添加10 %的胎牛血清(杭州四季青生物工 程材料有限公司）；
[0031] DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin、各種抗生素以及DH5 a、DHlO β菌株等均購自 Invitrogen ；
[0032] LB液體培養(yǎng)基由0. 5g蛋白胨，0. 25g酵母提取物，0. 5g氯化鈉，加50ml水配置而 成；
[0033] LB固體培養(yǎng)基由0· 5g蛋白胨，0· 25g酵母提取物，0· 5g氯化鈉，Ig瓊脂，加50ml 水配置而成；
[0034] 昆蟲細(xì)胞裂解液由 IOmM Tris. Cl, 130mM NaCl，1%(V/V)Triton X-100, IOmM NaF, IOmM磷酸鈉，IOmM焦磷酸鈉，pH7. 5,過濾除菌制得，使用前加入蛋白酶抑制劑PMSF ;
[0035] 腸激酶酶解緩沖液由20mM tris，IOOmM NaCl配制而成，PH7. 8。
[0036] 實施例1 :質(zhì)粒和重組病毒的構(gòu)建
[0037] 化學(xué)合成AP2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，并在目的片段的上 游引入腸激酶酶切位點序列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)。合成的DNA片段直接克隆到質(zhì)粒 pFastBacHta中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFast_His_AP2,該質(zhì)粒表達(dá)His融合的AP2。
[0038] 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BmDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟為：將10 μ 1重組質(zhì)粒連接 混合物加入到200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30min，置于42°C水浴熱擊45s，迅速 置于冰上2min，然后加入800 μ I S. 0. C培養(yǎng)基中，37°C搖床振搖4h，取部分稀釋菌液涂布 在含有卡那霉素（50μ g/ml)、慶大霉素（7μ g/ml)、四環(huán)素（10μ g/ml)、X-gal和IPTG的 LB培養(yǎng)板上，37°C培養(yǎng)48h，重組質(zhì)粒進入大腸桿菌BmDHlOBac細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)座子的幫助下， 外源基因轉(zhuǎn)座進入大腸桿菌BmDHlOBac中的BmBacmid轉(zhuǎn)座位點中。由于轉(zhuǎn)座祀位點位于 LacZa基因片段內(nèi)部，轉(zhuǎn)座發(fā)生后，于LacZa基因的閱讀框被打破，使轉(zhuǎn)座發(fā)生前后的大 腸桿菌BmDHlOBac在X-gal的作用下顯示出不同的顏色(藍(lán)色、白色)。如圖1所示，轉(zhuǎn)座時， 左邊質(zhì)粒中虛線框內(nèi)的是轉(zhuǎn)座子部分，其中包括外源基因 AP，整個轉(zhuǎn)座子原件在大腸桿菌 BmDHlOBac內(nèi)特異性的插入到BmBacmid中的轉(zhuǎn)座祀位點中，從而完成外源基因到桿狀病毒 基因組的整合。
[0039] 在含有100~200個菌斑的培養(yǎng)板上挑選約10個白色菌落，接著在新的培養(yǎng)板