卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛;
[0037](4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。例如，采用超濾和/或差速離心法從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸
[0038]在本發(fā)明的另一個實施方案中，上述制備方法采用逆轉(zhuǎn)錄病毒法，具體包括以下步驟:
[0039](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；優(yōu)選地，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸連接在逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR下部；更優(yōu)選地，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成高滴度病毒顆粒。
[0040](2)將步驟(I)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入乳牛受精卵細(xì)胞；這樣包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因被整合到乳牛受精卵細(xì)胞的基因組。
[0041](3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛;
[0042](4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0043]在本發(fā)明的又一個實施方案中，上述制備方法采用胚胎干細(xì)胞(embryonic stemcell, ES細(xì)胞)法,具體包括以下步驟:
[0044](I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；
[0045](2)將步驟⑴構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛胚胎干細(xì)胞；
[0046](3)將步驟(2)制得的乳牛胚胎干細(xì)胞與乳牛胚囊細(xì)胞混合(例如通過囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宮中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛；優(yōu)選地，可以再利用生殖系嵌合子代設(shè)計進(jìn)行交配育種獲得純系。
[0047](4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0048]對上述技術(shù)方案獲得的轉(zhuǎn)基因乳牛的遺傳性能進(jìn)行觀察和研究，結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)基因乳牛均可以作為生物反應(yīng)器高效穩(wěn)定地生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
[0049]本發(fā)明制備的生物反應(yīng)器可以大量、穩(wěn)定和高效地制備抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸，實驗表明本發(fā)明制備的抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸可以在HCV感染者體內(nèi)招募沉默復(fù)合體，特異性切割HCV基因組，從而殺滅病毒。可以將其制備成藥物，例如注射劑；食品，例如乳制品以及保健品用于丙型肝炎病毒患者或者HCV病毒感染者的治療。也可以將其應(yīng)用于受體細(xì)胞，包括被HCV感染的細(xì)胞株、細(xì)胞系、細(xì)胞原代培養(yǎng)物或組織，進(jìn)行HCV的研究和實驗。
【附圖說明】
[0050]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中:
[0051]圖1為實施例1構(gòu)建的載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0052]可以理解的是，在此描述的特定實施方式是通過舉例的方式來說明的，其并不作為對本發(fā)明的限制。在不偏離于本發(fā)明的范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到或能夠確認(rèn).僅僅使用常規(guī)實驗，許多等同物都能應(yīng)用于本發(fā)明所描述的特定步驟中。這些等同物被認(rèn)為處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且被權(quán)利要求所覆蓋。
[0053]實施例1
[0054]為了使siRNA表達(dá)基因插入到受體細(xì)胞中，本實施例通過構(gòu)建siRNA永久性表達(dá)載體，用其轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，同時選擇載體成功插入到宿主細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)基因克隆，為轉(zhuǎn)基因乳腺生物發(fā)生器的建立奠定基礎(chǔ)。
[0055]具體步驟包括:
[0056](I)針對HCV病毒基因組，人工合成的編碼siRNA的序列；
[0057](2)構(gòu)建慢病毒載體:將人工合成的編碼siRNA的序列插入到病毒載體pLenti6.3/V5-DEST (invitrogen,美國),構(gòu)建重組載體。載體結(jié)構(gòu)示意圖如I所示；
[0058](3)病毒包裝:采用重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以包裝病毒。具體包括以下步驟:
[0059]I) 293T 細(xì)胞(美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，American Type Culture Collect1n,)的培養(yǎng):在添加10%胎牛血清(Gibco，美國)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)中5% CO2,37°C下培養(yǎng)293T細(xì)胞。
[0060]2)將合適數(shù)量的細(xì)胞接種于4X 1cm培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)。
[0061]3)用包裝質(zhì)粒(Invitrogen,美國)和病毒載體共轉(zhuǎn)染；
[0062]4)換液，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0063]5)收集病毒液；2000g離心10分鐘去除細(xì)胞及碎片，并過0.45 μ m濾膜，獲得病毒原液，濃縮病毒液，重懸于400 μ I培養(yǎng)基中。
[0064]6病毒活性滴度的測定:將ΗΕΚ293細(xì)胞(美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，American TypeCulture Collect1n)接種于96孔板，梯度稀釋病毒液，加入HEK293細(xì)胞中，72小時后觀察帶GFP熒光的細(xì)胞，計算病毒活性滴度。HEK293細(xì)胞采用添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，在5% C02、37°C下培養(yǎng)。
[0065](4)病毒侵染及單克隆陽性克隆篩選。具體包括以下步驟:
[0066]I)培養(yǎng)受體細(xì)胞，具體為牛早期胚胎細(xì)胞；
[0067]2)將合適數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)；
[0068]3)用前期制備的病毒侵染受體細(xì)胞；
[0069]4)換液，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0070]5)加抗性篩選(必要時采用流式分選陽性細(xì)胞)；挑多個單克隆篩選陽性克?。?br>[0071]6)得到基因整合成功的受體細(xì)胞。
【主權(quán)項】
1.一種用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應(yīng)器的制備方法，該制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體； (2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛受體細(xì)胞，所述受體細(xì)胞為受精卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或早期胚胎； (3)利用步驟(2)制得的乳牛受體細(xì)胞通過假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述載體還包含一種或多種選自半乳糖基因啟動子、酪蛋白啟動子、乳球蛋白啟動子、S1-酪蛋白基因啟動子、乳清酸蛋白啟動子和乳清蛋白基因啟動子的基因序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體； (2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛受精卵細(xì)胞； (3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；優(yōu)選地，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸連接在逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR下部；更優(yōu)選地，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成高滴度病毒顆粒； (2)將步驟(I)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入乳牛受精卵細(xì)胞； (3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體； (2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛胚胎干細(xì)胞； (3)將步驟(2)制得的乳牛胚胎干細(xì)胞與乳牛胚囊細(xì)胞混合(例如通過囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宮中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛；優(yōu)選地，可以再利用生殖系嵌合子代設(shè)計進(jìn)行交配育種獲得純系。
6.一種抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法，該制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體； (2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)人受體細(xì)胞，所述受體細(xì)胞為乳牛受精卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或早期胚胎； (3)利用步驟(2)制得的乳牛受體細(xì)胞通過假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛； (4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述載體還包含一種或多種選自半乳糖基因啟動子、酪蛋白啟動子、乳球蛋白啟動子、S1-酪蛋白基因啟動子、乳清酸蛋白啟動子和乳清蛋白基因啟動子的基因序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (I)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體； (2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)人乳牛受精卵細(xì)胞； (3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛; (4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；優(yōu)選地，所述抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸連接在逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR下部；更優(yōu)選地，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成高滴度病毒顆粒； (2)將步驟(I)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入乳牛受精卵細(xì)胞； (3)將步驟(2)制得的乳牛受精卵細(xì)胞置于假孕乳牛輸卵管中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛; (4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體； (2)將步驟(I)構(gòu)建的載體導(dǎo)人乳牛胚胎干細(xì)胞； (3)將步驟(2)制得的乳牛胚胎干細(xì)胞與乳牛胚囊細(xì)胞混合(例如通過囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宮中發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛；優(yōu)選地，可以再利用生殖系嵌合子代設(shè)計進(jìn)行交配育種獲得純系； (4)從步驟(3)制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的制備方法，其包括用于生產(chǎn)抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的生物反應(yīng)器的制備方法，即構(gòu)建包含編碼抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸的基因序列的載體；將構(gòu)建的載體導(dǎo)入乳牛受體細(xì)胞，所述受體細(xì)胞為受精卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或早期胚胎；利用制得的乳牛受體細(xì)胞通過假孕乳牛發(fā)育并獲得轉(zhuǎn)基因乳牛。從制得的轉(zhuǎn)基因乳牛分泌的牛乳中獲得抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸。本發(fā)明的生物反應(yīng)器可以大量、穩(wěn)定和高效地制備抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸，實驗表明本發(fā)明制備的抗丙型肝炎病毒小干擾核糖核酸可以在HCV感染者體內(nèi)招募沉默復(fù)合體，特異性切割HCV基因組，從而殺滅病毒。
【IPC分類】A61D19-04, C12N15-113, C12N15-10, A01K67-027, C12N15-867, C12N15-85
【公開號】CN104805082
【申請?zhí)枴緾N201410035528
【發(fā)明人】張辰宇
【申請人】江蘇命碼生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年1月24日