串聯(lián)表達(dá)的siRNA及其在治療慢性淋巴細(xì)胞白血病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種串聯(lián)表達(dá)針對(duì)BTK的SiRNA的方法、串 聯(lián)表達(dá)的siRNA及其在治療慢性淋巴細(xì)胞白血病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL)，簡(jiǎn)稱慢淋，是一種 進(jìn)展較緩慢的成熟B淋巴細(xì)胞增殖性疾病。
[0003] -半以上的CLL病例13ql4純合性或雜合性丟失，是CLL最常見的染色體異常，特 征是機(jī)體的淋巴細(xì)胞在體內(nèi)異常增生和積蓄伴有免疫功能低下。CLL多見于中老年人，50 歲以上占90%，男性易患。CLL起病隱襲，臨床特征多樣，可呈現(xiàn)惰性或侵襲性，患者存活時(shí) 間從1年到15年以上不等，其發(fā)病機(jī)理尚不十分明確。
[0004] 目前，對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后因素的認(rèn)識(shí)還不十分明確，使得患者不能像急 性白血病患者那樣根據(jù)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)選擇相應(yīng)的治療手段。對(duì)于患者來(lái)說，即使是預(yù)后最差者 其預(yù)期生存期也有數(shù)年。
[0005] 在治療時(shí)考慮的因素包括疾病進(jìn)展、臨床癥狀、腫瘤負(fù)荷、年齡、并發(fā)癥、不利預(yù)后 因素和治療對(duì)生存期的影響等。目前，除了造血干細(xì)胞移植外，對(duì)于CLL尚無(wú)有效的治療手 段。典型的醫(yī)院治療慢性粒細(xì)胞白血病的方法主要采用化療、放療、干擾素治療、骨髓移植 等方法，但是治療效果都不是很理想，并不能改變本病的自然進(jìn)程。
[0006] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的有效治療CLL的方法和藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種可用于治療CLL的方法以及相應(yīng)的藥物。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組的用于抑制酪氨酸激酶的核酸序列，所述 的核酸序列的結(jié)構(gòu)如式V所示：
[0009] A- (B-L-) p-Z (式 V)
[0010]式中，
[0011] A為任選的5'端的序列（較佳地長(zhǎng)度為0-50bp，更佳地0-20bp，最佳地O-IObp);
[0012] B為相同或不同的、特異性抑制酪氨酸激酶的siRNA序列，或者用于產(chǎn)生所述 siRNA序列的前體RNA序列；
[0013] L為任選的間隔序列（較佳地長(zhǎng)度為0-50bp，更佳地0-20bp，最佳地O-IObp);
[0014] p為1、2、3、4或5的正整數(shù)；
[0015] Z為任選的5'端的序列（較佳地長(zhǎng)度為0-50bp，更佳地0-20bp，最佳地O-IObp)。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列包括DNA序列和RNA序列。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的B是序列選自SEQ ID NO. : 1、2或3的siRNA、或用于產(chǎn) 生所述siRNA的前體RNA。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組的用于抑制酪氨酸激酶的核酸序列是選自下組的一 種或多種活性成分：
[0019] (a).抑制酪氨酸激酶的siRNA，其中所述的siRNA包括序列如SEQ ID NO. : 1-3所 述的siRNA序列；
[0020] (b).前體RNA，所述的前體RNA能在宿主內(nèi)加工成（a)中所述的抑制酪氨酸激酶 的 siRNA ;
[0021] (C).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主轉(zhuǎn)錄形成（b)中所述的前體RNA，并加工 形成（a)中所述的siRNA ;
[0022] (d).表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有（a)中所述的抑制酪氨酸激酶的siRNA、或（b) 中所述的前體RNA、或（c)中所述的多核苷酸，并且所述式V中，A和Z相連形成環(huán)狀。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸序列是串聯(lián)表達(dá)2種或多種不同siRNA序列的核酸 序列。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的"重組的"包括人工合成的。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的前體RNA能在宿主（如哺乳動(dòng)物，包括人）內(nèi)加工成（a) 中所述的siRNA。
[0026] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接 受的載體和有效量的選自下組的一種或多種活性成分：
[0027] (a).抑制酪氨酸激酶的siRNA，其中所述的siRNA包括序列如SEQ ID NO. : 1-3中 任一所述的siRNA序列；
[0028] (b).前體RNA，所述的前體RNA能在宿主內(nèi)加工成（a)中所述的抑制酪氨酸激酶 的 siRNA ;
[0029] (c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主轉(zhuǎn)錄形成（b)中所述的前體RNA，并加工 形成（a)中所述的siRNA ;
[0030] (d).表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有（a)中所述的抑制酪氨酸激酶的siRNA、或（b) 中所述的前體RNA、或（c)中所述的多核苷酸；和
[0031] (e). (a)中所述的siRNA的激動(dòng)劑。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，（c)中所述的多核苷酸串聯(lián)表達(dá)相同或不同的所述siRNA。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，（a)中所述siRNA包括未修飾的形式以及或經(jīng)修飾的形式。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的經(jīng)修飾的形式選自下組的一種或多種修飾形式：核苷酸 的糖基修飾、核苷酸之間連接方式的修飾、膽固醇修飾、鎖核苷酸修飾、肽段修飾、脂類修 飾、鹵素修飾、烴基修飾、和核酸修飾。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸的糖基修飾包括2-0-甲基的糖基修飾、2-0-甲氧 乙酯的糖基修飾、2-0-烷基的糖基修飾、2-氟代的糖基修飾、糖環(huán)修飾、鎖核苷酸修飾；和/ 或
[0036] 所述的核苷酸之間連接方式的修飾包括硫代磷酸修飾、磷酸烷基化修飾。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的修飾形式包括式I所示的結(jié)構(gòu)的化合物單體或其多聚 體：
[0038] (X) n- (Y) m
[0039] 式 I，
[0040] 在式I中，
[0041] 各X為（a)中所述的siRNA ;
[0042] 各Y獨(dú)立地為促進(jìn)siRNA施藥穩(wěn)定性的修飾物；
[0043] Y連接于X的左偵彳、右側(cè)或中間；
[0044] η為1-100的（較佳地1-20)正整數(shù)（較佳地η為1、2、3、4或5);
[0045] m為1-1000的（較佳地1-200)正整數(shù)；
[0046] 各""表示接頭、化學(xué)鍵、或共價(jià)鍵。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的接頭是長(zhǎng)度為1-10個(gè)堿基的核酸序列。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的Y包括（但不限于）膽固醇、類固醇、甾醇、醇、有機(jī)酸、月旨 肪酸、酯、單糖、多糖、氨基酸、多肽、單核苷酸、多核苷酸。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，（c)所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO. :7所示。
[0050] TTCACTGGACTCTTCACCTCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGAGGTGAAGTCCAGTGAACAGGACA CA AGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT GTTAGCA GTTGCTCAGCCTGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCAGGCTGCAACTGCTAACAGGACACAAG GCCTGT