活性蛋白基因在蘆薈中融合表達(dá)應(yīng)用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及活性蛋白基因在蘆薈中融合表達(dá)應(yīng)用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活性蛋白是一種復(fù)雜的有機(jī)化合物，組成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈。蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈組成的生物大分子，每一條多肽鏈有二十至數(shù)百個(gè)氨基酸殘基不等；各種氨基酸殘基按一定的順序排列。
[0003]蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由對(duì)應(yīng)基因所編碼。除了遺傳密碼所編碼的20種“標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸，在蛋白質(zhì)中，某些氨基酸殘基還可以被翻譯后修飾而發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行激活或調(diào)控。多個(gè)蛋白質(zhì)可以一起，往往是通過結(jié)合在一起形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物，發(fā)揮某一特定功能，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞器是核糖體。
[0004]活性蛋白對(duì)環(huán)境的要求很高，高濃度的生物蛋白在常溫下保存很容易失去活性，為了確保這些珍稀成分的特殊活性與功能，只能采取生物凍干工藝，在無菌環(huán)境下采用-80度的極速超低溫真空凍干技術(shù)，使生物活性蛋白進(jìn)入休眠狀態(tài)，達(dá)到完整的保存其生物活性的目的。
[0005]隨著人年紀(jì)的增大，本身皮膚表達(dá)的蛋白(尤其是膠原蛋白)會(huì)下降，導(dǎo)致皮膚會(huì)越來越不好，市場(chǎng)上化妝品添加的活性肽物質(zhì)如EGF即重組人表皮生長(zhǎng)因子，都是采用工程菌表達(dá)純化，水溶后不易保存，而且生產(chǎn)成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種活性蛋白基因在蘆薈中融合表達(dá)應(yīng)用的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]活性蛋白基因在蘆薈中融合表達(dá)應(yīng)用的方法，包括以下步驟:
[0009](一)、構(gòu)建 pCOMBIA 1301+MT/EGF、pCOMBIA 1301+MT/AFGF、pCOMBIA 1301+MT/BFGF, pCOMBIA 1301+MT/KGF、pCOMBIA 1301+MT/PIGF、pCOMBIA 1301+EGF/AFGF、pCOMBIA1301+EGF/BFGF、pCOMBIA 1301+EGF/KGF、pCOMBIA 1301+EGF/PIGF、pC0MBIA1301+PDGF、pCOMBIA 1301+MT/PIGF-2,pCOMBIA 1301+EGF/PIGF-2,pCOMBIA 1301+adiponectin 植物轉(zhuǎn)基因載體；
[0010](二)、用步驟(一)中的13個(gè)植物轉(zhuǎn)基因載體的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化LBA4404和EHA105農(nóng)桿菌，劃線培養(yǎng)，挑取單菌落做菌落PCR鑒定，得到正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)；
[0011](三)、培養(yǎng)至0D600= 0.1-0.2，收集菌體懸浮于等體積MS培養(yǎng)基中，浸染蘆薈愈傷組織15-30分鐘；
[0012](四)、除去蘆薈愈傷組織上的農(nóng)桿菌，把浸染后的蘆薈愈傷組織放到MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；三天后用含抗生素Kan和頭孢霉素的液體MS培養(yǎng)基中漂洗蘆薈愈傷組織至徹底洗去農(nóng)桿菌，除去水分；
[0013](五)、除去水分后的蘆薈愈傷組織置于含Kan和頭孢霉素抗生素的MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，I個(gè)月后愈傷組織生出芽來，繼代培養(yǎng)，2個(gè)月后生出小葉，葉長(zhǎng)大至2-3cm后，繼代生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，1-2個(gè)月愈傷組織下部生出2-3根白色根；
[0014](六)、把蘆薈組織放到陰涼地方種植于營(yíng)養(yǎng)土上，采用22度1000-20001UX光照培養(yǎng)得到能特異表達(dá)目的蛋白的蘆薈植株。
[0015]在上述技術(shù)方案的所述步驟(四)中，用無菌濾紙吸干蘆薈愈傷組織上的農(nóng)桿菌，采用無菌濾紙吸干水分，避免轉(zhuǎn)基因植物壞死。
[0016]所述步驟(五)中，用無菌濾紙吸干蘆薈愈傷組織上的水分，采用無菌濾紙吸干水分，避免轉(zhuǎn)基因植物壞死。
[0017]在上述技術(shù)方案的步驟(二 )中轉(zhuǎn)化子檢測(cè)方法:用特異引物以單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如擴(kuò)增出和目的片段一樣的條帶，該為轉(zhuǎn)化子正確的轉(zhuǎn)化子。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0019]本發(fā)明采用農(nóng)桿菌浸染蘆薈組織，把活性蛋白應(yīng)用于蘆薈中，以蘆薈為平臺(tái)大量生產(chǎn)人需要的活性肽，一方面從源頭直接參與皮膚細(xì)胞的基因表達(dá)與生理信號(hào)的傳遞，修復(fù)細(xì)胞，阻斷老化，另一方面營(yíng)養(yǎng)肌膚，提高肌膚自身的調(diào)節(jié)能力，立體構(gòu)建和維護(hù)皮膚的生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)逆齡護(hù)膚，達(dá)到美容目的，本發(fā)明采1-3年的蘆薈葉子為原料，轉(zhuǎn)基因蘆薈不會(huì)開花結(jié)果，不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染，生產(chǎn)的富含活性肽的蘆薈易保存，而且生產(chǎn)成本低，適于大批量生產(chǎn)。
[0020]目前國(guó)內(nèi)成功運(yùn)用轉(zhuǎn)基因蘆薈進(jìn)行活性蛋白生產(chǎn)的成功案例幾乎沒有，本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過無數(shù)次蘆薈轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，成功實(shí)現(xiàn)了蘆薈轉(zhuǎn)基因，使得大量生產(chǎn)活性肽如表皮生長(zhǎng)因子成為能夠?qū)嵤┑默F(xiàn)實(shí)，基本滿足需求量每年達(dá)幾十噸的市場(chǎng)需求。本發(fā)明以本身為一種美容植物的蘆薈為載體，表達(dá)特異的有美容功效的活性肽，活性肽由蘆薈自身表達(dá)，蘆薈對(duì)自身表達(dá)的活性肽形成保護(hù)機(jī)制，減少因工程表達(dá)活性肽而帶來的環(huán)境污染，同時(shí)活性肽由蘆薈自身表達(dá)易保存。
[0021]本發(fā)明生產(chǎn)的富含活性肽的蘆薈，制成的蘆薈凝膠汁液，富含活性肽，易保存，生產(chǎn)成本低，適于大批量生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023]本發(fā)明提供的活性蛋白基因在蘆薈中融合表達(dá)應(yīng)用的方法，構(gòu)建PC0MBIA1301+MT/EGF、pC0MBIA1301+MT/AFGF、pC0MBIA1301+MT/BFGF、pC0MBIA1301+MT/KGF、pC0MBIA1301+MT/PIGF、pC0MBIA1301+EGF/AFGF、pC0MBIA1301+EGF/BFGF、PC0MBIA1301+EGF/KGF、p⑶MBIA1301+EGF/PIGF、pC0MBIA1301+PDGF、pC0MBIA1301+MT/PIGF-2、pC0MBIA1301+EGF/PIGF-2、pC0MBIA1301+adiponectin 植物轉(zhuǎn)基因載體，分別用構(gòu)建的13個(gè)植物轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LBA4404和EHA105農(nóng)桿菌，劃線培養(yǎng)，挑取單菌落做菌落PCR鑒定，得到正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，用特異引物以單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如擴(kuò)增出和目的片段一樣的條帶，該為轉(zhuǎn)化子正確的轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)至0D600 = 0.1-0.2，收集菌體懸浮于等體積MS培養(yǎng)基中，浸染蘆薈愈傷組織15-30分鐘，用無菌濾紙吸干組織上的農(nóng)桿菌。把浸染后的蘆薈愈傷組織放到MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。三天后用液體MS培養(yǎng)基含抗生素(Kan和頭孢霉素)漂洗組織8-10次，徹底洗去農(nóng)桿菌，用無菌的濾紙吸干水分，置于含抗生素(Kan和頭孢霉素)MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。I個(gè)月后愈傷組織能生出芽來，繼代培養(yǎng)，2個(gè)月后可以生出小葉，等葉長(zhǎng)大至2-3cm后，繼代生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，1-2個(gè)月愈傷組織下部會(huì)生出2-3根白色小根，洗去培養(yǎng)基，把蘆薈組織放到陰涼地方，種植于營(yíng)養(yǎng)土上，采用22度1000-20001uX光照培養(yǎng)得到能特異表達(dá)目的蛋白的蘆薈植株。
[0024]本實(shí)施例中:
[0025]MT/EGF融合基因序列:
[0026]ATGGACCCCAACTGCTCCTGCGAGGCTGGTGGCTCCTGCGCCTGCGCCGGCTCCTGCAAGTGCAAAAAGTGCAAATGCACCTCCTGCAAGAAGAGCTGCTGCTCCTGTTGCCCCCTGGGCTGTGCCAAGTGTGCCCAGGGCTGCATCTGCAAAGGGGCGTCAGAGAAGTGCAGCTGCTGTGCCAACTCTGACTCTGAATGTCCGCTGAGCCATGACGGTTATTGCCTGCATGATGGCGTGTGCATGTACATCGAAGCGCTGGACAAGTATGCCTGTAACTGCGTGGTGGGCTATATCGGCGAACGCTGTCAGTACCGTGATCTGAAATGGTGGGAACTG
[0027]MT/AFGF融合基因序列:
[0028]ATGGACCCCAACTGCTCCTGCGAGGCTGGTGGCTCCTGCGCCTGCGCCGGCTCCTGCAAGTGCAAAAAGTGCAAATGCACCTCCTGCAAGAAGAGCTGCTGCTCCTGTTGCCCCCTGGGCTGTGCCAAGTGTGCCCAGGGCTGCATCTGCAAAGGGGCGTCAGAGAAGTGCAGCTGCTGTGCCGCTGAAGGGGAAATCACCACCTTCACAGCCCTGACCGAGAAGTTTAATCTGCCTCCAGGGAATTACAAGAAGCCCAAACTCCTCTACTGTAGCAACGGGGGCCACTTCCTGAGGATCCTTCCGGATGGCACAGTGGATGGGACAAGGGACAGGAGCGACCAGCACATTCAGCTGCAGCTCAGTGCGGAAAGCGTGGGGGAGGTGTATATAAAGAGTACCGAGACTGGCCAGTACTTGGCCATGGACACCGACGGGCTTTTATACGGCTCACAGACACCAAATGAGGAATGTTTGTTCCTGGAAAGGCTGGAGGAGAACCATTACAACACCTATATATCCAAGAAGCATGCAGAGAAGAATTGGTTTGTTGGCCTCAAGAAGAATGGGAGCTGCAAACGCGGTCCTCGGACTCACTATGGCCAGAAAGCAATCTTGTTTCTCCCCCTGCCAGTCTCTTCTGATTAA
[0029]MT/BFGF融合基因序列:
[0030]ATGGACCCCAACTGCTCCTGCGAGGCTGGTGGCTCCTGCGCCTGCGCCGGCTCCTGCAAGTGCAAAAAGTGCAAATGCACCTCCTGCAAGAAGAGCTGCTGCTCCTGTTGCCCCCTGGGCTGTGCCAAGTGTGCCCAGGGCTGCATCTGCAAAGGGGCGTCAGAGAAGTGCAGCTGCTGTGCCTGGGTGTGGGGGGTGGAGATGTAGAAGATGTGACGCCGCGGCCCGGCGGGTGCCAGATTAGCGGACGCGGTGCCCGCGGTTGCAACGGGATCCCGGGCGCTGCAGCTTGGGAGGCGGCTCTCCCCAGGCGGCGTCCGCGGAGACACCCATCCGTGAACCCCAGGTCCCGGGCCGCCGGCTCGCCGCGCACCAGGGGCCGGCGGACAGAAGAGCGGCCGAGCGGCTCGAGGCTGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGGGGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGCGCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACCATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAA
CAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTG
[0031]MT/KGF融合基因序列:
[0032]ATGGACCCCAACTGCTCCTGCGAGGCTGGTGGCTCCTGCGCCTGCGCCGGCTCCTGCAAGTGCAAAAAGTGCAAATGCACCTCCTGCAAGAAGAGCTGCTGCTCCTGTTGCCCCCTGGGCTGTGCCAAGTGTGCCCAGGGCTGCATCTGCAAAGGGGCGTCAGAGAAGTGCAGCTGCTGTGCCTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCCTCAGCCTTTCCCCACCTGCCCGGCTGCTGCTGCTGCTGCTTTTTGTTGCTGTTCTTGGTGTCTTCCGTCCCTGTCACCTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATGGTGTCACCAGAGGCCACCAACTCTTCTTCCTCCTCCTTCTCCTCTCCTTCCAGCGCGGGAAGGCATGTGCGGAGCTACAATCACCTTCAAGGAGATGTCCGCTGGAGAAAGCTATTCTCTTTCACCAAGTACTTTCTCAAGATTGAGAAGAACGGGAAGGTCAGCGGGACCAAGA