一種測試純系水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種測試純系水稻新品種的特異性、一致性 與穩(wěn)定性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為一種特化的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，植物新品種已經(jīng)成為一個(gè)公司及至一個(gè)國家的核心競 爭力。植物新品種授權(quán)與相關(guān)法律問題的解決依賴于DUS測試，即對(duì)待測水稻品種的特異 性（Distinctness)、一致性（Uniformity)和穩(wěn)定性（Stability)的田間種植鑒定或室內(nèi)分 子標(biāo)記鑒定。田間種植鑒定流程為：將待測水稻品種與近似品種同時(shí)植于田間，在2年及以 上的生長季節(jié)內(nèi)，觀察它們的多個(gè)性狀，根據(jù)性狀表現(xiàn)判斷待測水稻品種與近似品種的差 異顯著性，即特異性，同時(shí)判斷群體內(nèi)雜株比例，即一致性和穩(wěn)定性；室內(nèi)分子標(biāo)記鑒定的 流程為：分單株提取待測水稻品種與近似品種中每個(gè)樣本的DNA，并分別對(duì)每個(gè)樣本的每 個(gè)測試區(qū)域進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng)），并對(duì)每個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn) 行電泳或一代測序檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，獲得待測水稻品種與近似品種的差異位點(diǎn)比例，根 據(jù)差異位點(diǎn)比例，判斷待測水稻品種的特異性。
[0003] 田間種植鑒定的缺點(diǎn)是：周期長、工作量大，環(huán)境影響性狀，導(dǎo)致判斷不準(zhǔn)確。室內(nèi) 分子標(biāo)記鑒定的缺點(diǎn)是：需要分別處理每個(gè)樣本的每個(gè)測試區(qū)域，工作量大，不能對(duì)樣本與 測試區(qū)域大量抽樣，無法計(jì)算雜株率，因而無法進(jìn)行穩(wěn)定性與一致性的測試。田間種植鑒定 與室內(nèi)分子標(biāo)記鑒定的共同缺點(diǎn)是：均由于工作量的原因，無法從現(xiàn)有品種中客觀選擇近 似品種，只能由品種權(quán)申請(qǐng)人提供，而基于商業(yè)利益等動(dòng)機(jī)，品種權(quán)申請(qǐng)人提供的近似品種 可能不真實(shí)，從而造成錯(cuò)誤品種授權(quán)的法律后果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種測試純系水稻新品種的特 異性、一致性與穩(wěn)定性的方法。所述技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種測試純系水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方 法，所述方法包括：
[0006] 獲得不同水稻品種間的變異位點(diǎn)；
[0007] 通過所述變異位點(diǎn)確定待測水稻品種的測試區(qū)域，所述測試區(qū)域包括通用測試區(qū) 域，至少部分所述變異位點(diǎn)包含在所述通用測試區(qū)域內(nèi)；
[0008] 構(gòu)建包含所述待測水稻品種在所有所述測試區(qū)域的基因型的數(shù)據(jù)庫；
[0009] 確定所述待測水稻品種的抽樣量SN后，隨機(jī)抽樣混合并提取混合樣本的DNA ;
[0010] 制備擴(kuò)增所述測試區(qū)域的引物，所述引物包括通用測試區(qū)域引物；
[0011] 利用所述引物對(duì)所述混合樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到所述測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物， 所述擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建高通量測序文庫；
[0012] 對(duì)所述高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到測序片段組；
[0013] 分析所述測序片段組，獲得待測水稻品種基因型和雜株基因型；
[0014] 將所述待測水稻品種基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得 所述待測水稻品種的近似品種、變異位點(diǎn)和變異位點(diǎn)率；
[0015] 將所述雜株基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得雜株品種 后，計(jì)算雜株率；
[0016] 利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所述雜株率，判斷所述待測水稻品種特異 性、一致性和穩(wěn)定性。
[0017] 具體地，所述抽樣量5抑茜足如下條件出預(yù)0^1階^]?，0.95)/5^^彡1.15柳，其中 ΒΙΝ0Μ. INV為excel 2010中的函數(shù)，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時(shí)所選用的閾值，所述抽 樣量SN的公式含義為：即使所述雜株率只超出一致性和穩(wěn)定性時(shí)的判斷閾值M的15%，所 述抽樣量在95%的概率保證下，可正確判斷所述待測水稻品種的穩(wěn)定性與一致性。
[0018] 具體地，所述高通量測序的深度CF滿足如下條件：BIN0M.DIST(10, ΙΟ,ΒΙΝΟΜ. DIST (8, 20, ΒΙΝ0Μ. DIST (0, CF, 0.1 % , TRUE), TRUE), FALSE) ^ 99.9 %,1-ΒΙΝΟΜ. DIST(10000, 10000, 1-ΒΙΝ0Μ. DIST(8, 20, 1-ΒΙΝ0Μ. DIST(99. 99%*CF,CF, 99. 9989% , TRUE) ，TRUE)，F(xiàn)ALSE)彡 0· 1%且 ΒΙΝΟΜ. DIST(10*(1-M)*CF, 10*CF, 1-110% *Μ, TRUE)彡 95. 0%， 其中，CF為所述高通量測序的深度，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時(shí)所選用的閾值，BIN0M. DIST為excel 2010中的函數(shù)，所述高通量測序的深度CF的公式的含義為：在所述雜株 率低至0. 1%、所述雜株品種為10個(gè)且所述雜株品種與所述待測水稻品種間平均僅有20 個(gè)差異位點(diǎn)的條件下，由所述高通量測序的深度CF決定的檢出全部所述雜株品種的概率 多99. 9% ;在所述數(shù)據(jù)庫的品種為10000個(gè)且所述雜株品種與所述待測水稻品種間平均僅 有20個(gè)差異位點(diǎn)的條件下，由所述高通量測序的深度CF決定的存在誤判所述雜株品種的 概率< 0. 1% ;在所述雜株品種為10個(gè)且真實(shí)雜株率僅超過判斷特異性時(shí)所選用的閾值 的10%時(shí)，由所述高通量測序的深度CF決定的對(duì)穩(wěn)定性與一致性的判定結(jié)論正確的概率 彡 95. 0%〇
[0019] 具體地，所述測試區(qū)域還包括非通用測試區(qū)域，所述引物還包括非通用測試區(qū)域 引物。
[0020] 進(jìn)一步地，所述非通用測試區(qū)域引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物包 括第一正向引物和第一反向引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述 第一引物和所述第二引物分別進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增得到兩個(gè)所述非通用測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物，將 兩個(gè)所述非通用測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合用于構(gòu)建單獨(dú)擴(kuò)增的高通量測序文庫；
[0021] 所述第一正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1，所述第 一反向引物中的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2 ;
[0022] 所述第二正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2,所述第 二反向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1。
[0023] 進(jìn)一步地，利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所述雜株率，判斷所述待測品種 特異性、一致性和穩(wěn)定性的方法包括：
[0024] 當(dāng)所述變異位點(diǎn)率多SD或所述非通用測試區(qū)域存在所述變異位點(diǎn)時(shí)，所述待測 水稻品種具有特異性，當(dāng)所述變異位點(diǎn)率< SD且所述變異位點(diǎn)不存在于所述非通用測試 區(qū)域中時(shí)，所述待測水稻品種不具有特異性，其中，SD為判斷特異性時(shí)所選用的閾值；
[0025] 當(dāng)所述待測水稻品種的所述雜株率< M時(shí)，所述待測水稻品種具有一致性和穩(wěn)定 性，當(dāng)所述待測水稻品種的雜株率大于> M時(shí)，所述待測水稻品種不具有一致性和穩(wěn)定性， M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時(shí)所選用的閾值；
[0026] 所述雜株率R = R1+R2-R3-R4,其中：
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測試純系水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法，其特征在于，所述方法 包括： 獲得不同水稻品種間的變異位點(diǎn)； 通過所述變異位點(diǎn)確定待測水稻品種的測試區(qū)域，所述測試區(qū)域包括通用測試區(qū)域， 至少部分所述變異位點(diǎn)包含在所述通用測試區(qū)域內(nèi)； 構(gòu)建包含所述待測水稻品種在所有所述測試區(qū)域的基因型的數(shù)據(jù)庫； 確定所述待測水稻品種的抽樣量SN后，隨機(jī)抽樣混合并提取混合樣本的DNA ; 制備擴(kuò)增所述測試區(qū)域的引物，所述引物包括所述通用測試區(qū)域引物； 利用所述引物對(duì)所述混合樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到所述測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述 擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建高通量測序文庫； 對(duì)所述高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到測序片段組； 分析所述測序片段組，獲得待測水稻品種基因型和雜株基因型； 將所述待測水稻品種基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得所述 待測水稻品種的近似品種、變異位點(diǎn)和變異位點(diǎn)率； 將所述雜株基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較，獲得雜株品種后， 計(jì)算雜株率； 利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所述雜株率，判斷所述待測水稻品種特異性、一 致性和穩(wěn)定性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽樣量SN滿足如下條件：BINOM. 1階^]?，0.95)/5^^彡1.15柳，其中81勵(lì)^1階為61〇612010中的函數(shù)，]\1為判斷所述一 致性和穩(wěn)定性時(shí)所選用的閾值，所述抽樣量SN滿足的條件含義為：即使所述雜株率只超出 閾值M的15%，所述抽樣量在95%的概率保證下，可正確判斷所述待測水稻品種的穩(wěn)定性 與一致性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量測序的深度CF滿足如下條 件：BINOM. DIST (10, 10, BINOM. DIST (8, 20, BINOM. DIST (0, CF，0? 1 %，TRUE)，TRUE)，F(xiàn)ALSE) ^99. 9%, 1-BINOM. DIST(10000, 10000, 1-BINOM. DIST(8, 20, 1-BINOM. DIST(99. 99% *CF, C F，99.9989%,TRUE),TRUE)，F(xiàn)ALSE)彡 0? 1%且 BINO M.DIST(10*(1-M)*CF, 10*CF, 1-110% *M，TRUE)多95. 0 %，其中，CF為所述高通量測序的深度，M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時(shí)所 選用的閾值，BINOM. DIST為excel 20